热毒宁调节MCMV感染的肺炎模型小鼠肺组织内IFN-γ和IL-4水平的研究*

张文辉 左丽娜 孙　思 顾　翔 陈玉玲

（徐州医学院附属医院，江苏　徐州221002）

·实验报告·

热毒宁调节MCMV感染的肺炎模型小鼠肺组织内IFN-γ和IL-4水平的研究*

张文辉 左丽娜 孙思 顾翔 陈玉玲

（徐州医学院附属医院，江苏徐州221002）

目的观察热毒宁对鼠巨细胞病毒（MCMV）感染小鼠肺组织干扰素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）细胞因子水平的影响及其抗MCMV作用机制。方法40只BALB/c鼠随机分5组，每组8只，A为空白对照组，B为免疫低下对照组，C为MCMV肺炎模型组，D为热毒宁治疗组，E为更昔洛韦治疗组。HE染色观察小鼠肺组织的病理改变，荧光定量PCR检测肺组织MCMV DNA的变化，酶联免疫试验（ELISA）法检测肺组织中IFN-γ和IL-4的变化。结果1）与A组相比，C组肺组织病理染色显示肺泡壁内有大量炎性细胞浸润，肺泡壁增宽，部分肺泡腔内有蛋白渗出；MCMV DNA含量升高，肺组织中炎症因子IFN-γ和IL-4明显增多（P＜0.05）；2）与C组相比，给予药物干预后，D、E组肺组织病理改变较前减轻，MCMV DNA含量降低，炎性因子IFN-γ和IL-4明显下降（P＜0.05）；而D、E两组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论热毒宁干预后，肺组织的病理改变较前减轻，抑制CMV DNA的复制，IFN-γ和IL-4明显下降；此效应可能是通过抑制CMV的复制周期并干预下游细胞因子从而发挥抗病毒作用。

热毒宁更昔洛韦巨细胞病毒IFN-γIL-4

【Abstract】Objective：To investigate the effect and its anti-MCMV mechanism of Reduning Decoction on the expression of IFN-γand IL-4 of lung tissue in pneumonia model mice with MCMV infection.M ethods：40 BALB/cmice were randomly divided into five groups，8 in each：the normal control group（A），immunosuppressive control group（B），MCMV infection group（C），Reduning decoction group（D），and ganciclovir group（E）.The pathological changes of lung tissue inmice were observed by HE staining.Real time PCR was used to analyze expression of MCMV DNA；the expression of IFN-γand IL-4 was detected by ELISA.Results：Compared with the normal control group，the pathological changes of the lung tissue of themice in themodel group showed alveolar interstitial edema，alveolar wall wider and a large number of inflammatory cells；the number of MCMV DNA increased；the expression of IFN-γand IL-4 also increased significantly（P＜0.05）.Compared with themice in the model group，the pathological changes of the lung tissue of drug groups showed the inflammatory cells decreased；the number of MCMV DNA decreased，and the expression of IFN-γand IL-4 also decreased significantly（P＜0.05）.At the same time，the expression of IFN-γand IL-4 was no statistically significant between group D and E（P＞0.05）.Conclusion：After Reduning Decoction′s intervention，pathological changes of lung tissue decreased；the replication of CMV DNA was inhibited，and FN-γand IL-4 also decreased significantly.This effectmay be achieved by inhibiting the replication cycle of CMV and intervening downstream cytokines to exert antiviral effects.

【Key words】Reduning Decoction；Ganciclovir；Cytomegalovirus；IFN-γ；IL-4

巨细胞病毒（CMV）属β-疱疹病毒亚科，是一组可以在宿主细胞中建立终身潜伏感染的特异性的疱疹病毒。CMV易感染免疫缺陷患者的器官、组织，同时它也是导致移植患者移植物丧失的主要原因［1-2］。目前已有研究证实，不论是在巨细胞病毒感染的潜伏或活化期，肺部都是一个最主要的感染器官。由于目前可用的抗病毒药物有限以及长期低剂量的使用，以至于目前还

没有有效的药物以阻止CMV感染的炎症反应。热毒宁是新型中药制剂，目前已成为国内治疗病毒性疾病的一线用药。国内大量的临床研究已证实，热毒宁对病毒性肺炎有一定的治疗作用［3-4］，但它对CMV肺炎的作用以及对干扰素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）细胞因子的影响尚不明确。通过检测热毒宁对MCMV感染模型小鼠肺组织中IFN-γ和IL-4细胞因子表达强度的影响，从整体水平上探讨热毒宁对MCMV感染小鼠肺组织IFN-γ和IL-4细胞因子水平的影响及其抗MCMV作用机制。现报告如下。

1　材料及方法

1.1实验动物选择40只SPF级BALB/c雄性小鼠为研究对象，年龄均为8周龄（由徐州医学院试验动物中心提供），体质量23～27 g，平均（25.23±1.84）g，所有动物均在实验室内行标准化饲养。

1.2药物与试剂MCMV株由山东省医学科学院微生物研究所提供。DNA提取试剂盒购自北京天根生物有限公司，IFN-γ、IL-4的ELASA试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司，PCR引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.3分组与给药BALB/c鼠随机分5组，每组8只，A为空白对照组，B为免疫低下对照组，C为MCMV肺炎模型组，D为热毒宁治疗组，E为更昔洛韦治疗组。A组腹腔注射成纤维细胞0.8mL/只，C组腹腔注射MCMV悬液0.8 mL/只；D组腹腔注射热毒宁7.2 mL/kg，E组腹腔注射更昔洛韦60 mg/kg（每日1次，均连续给药7 d），A组、B组、C组分别予以同体积的0.9%氯化钠注射液腹腔注射。上述剂量均按人与动物用药量折算系数表计算用药量。

1.4标本采集与检测1）肺组织病理学。留取肺组织，甲醛固定，石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察组织病理学改变（×400）。2）实时荧光定量PCR检测MCMV DNA。将肺组织匀浆，离心后留取沉淀，按照DNA试剂盒说明分别提取肺组织中的MCMV-DNA。上游引物：5′-TCAGCCATCAACTCTGC TACCAAC-3′，下游引物：5′-ATCTGAAACAGCCGTA TATCATCTTG-3′。反应体系为10μL，DNA模板2μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，ddH2O 7μL，反应条件为95℃15 s，95℃5 s，58℃30 s，72℃10 s，40个循环。行琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察结果、拍照。3）ELASA法检测IFN-γ及IL-4的表达。将肺组织匀浆离心，留取上清液，严格按照ELISA说明行IFN-γ、IL-4的检测。

1.5统计学处理应用SPSS16.0统计软件分析。所有计量资料均以（表示，用单因素方差分析检验其差异性，组间两两比较用SNK检验完成。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组小鼠行为学异常表现情况比较A组和B组小鼠在实验期间未表现出行为异常，C、D、E 3组的小鼠在MCMV 3 d后表现出嗜睡、活动减少、毛发脱落等异常。给药后，D、E组小鼠用药7 d时行为异常表现有所减轻，与C组相比明显改善。

2.2光镜下的病理学改变见图1。A、B组未表现出明显的病理改变，C组小鼠肺泡壁和支气管周围肺间质内有大量的炎性细胞存在，主要表现为肺泡壁增宽，肺泡腔内有大量蛋白渗出，肺间质内大量单核细胞浸润表达。D组小鼠经热毒宁干预后，肺组织病理改变较C组减轻；且E组减轻较D组更明显。

图1　各组小鼠肺组织病理变化（HE染色，400倍）

2.3各组小鼠ELISA检测IFN-γ和IL-4水平比较见表1。与A组比较，C组IFN-γ和IL-4明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；B组无明显变化（P＞0.05）；D、E组IFN-γ和IL-4明显少于C组（P＜0.05），且E组下降较D组更明显（P＜0.05）。

表1　各组肺组织IFN-γ和MCP-1表达的比较（pg/mL，

表1　各组肺组织IFN-γ和MCP-1表达的比较（pg/mL，

与A组比较，△P＜0.05；与C组比较，*P＜0.05；与D组比较，▲P＜0.05。下同。

组别n IFN-γIL-4 A组8 21.37±4.49 28.57±3.86 B组8 23.14±3.32 29.75±5.75 C组8 275.57±17.45△11.86±3.95△D组8 104.64±23.47*20.65±4.36*E组8 98.72±19.57*▲21.63±4.58*▲

2.4各组小鼠荧光定量PCR检测MCMV-DNA表达比较见表2。与B组比较，C、D、E组的MCMV-DNA明显升高（P＜0.05）；经药物干预后MCMV-DNA较前下降（P＜0.05）；提示通过热毒宁干预后，MCMV的浓度显著降低。

表2　各组肺组织CMV-DNA的表达（Ig/mL，

表2　各组肺组织CMV-DNA的表达（Ig/mL，

组别n CMV-DNA A组8 1 B组8 1 C组8 4.52±1.13#D组8 2.37±0.44#*E组8 1.72±0.11#*

3　讨　论

CMV是一种普遍存在的机会性致病菌，是目前已知的人类最大的病毒之一。虽然免疫功能正常的个体感染CMV后无明显临床症状出现，但它可在体内建立终身潜伏感染［5］。而在免疫缺陷患者中，如移植接受者、HIV患者感染CMV后可导致严重的后果［6］。理解CMV是如何引起并损害机体免疫反应的，对有效治疗CMV具有重要作用。

研究显示［7-8］，机体受到MCV感染后发生免疫紊乱的机制十分复杂，目前主要认为与细胞因子作用和细胞因子的表达失衡有着重要关系。细胞因子作为机体内免疫细胞分泌的对细胞功能具有调节作用的小分子多肽类物质，是调控细胞间相互作用、调节细胞生长和分化的主要功能性物质，细胞因子水平和功能的失衡则决定了细胞功能特别是免疫功能的状态［9-10］。机体中，Th作为主要的免疫细胞，其主要分化形式为Th1细胞和Th2细胞，Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等因子，是介导细胞毒性和局部炎症的关节因子，广泛参与细胞的免疫反应。相对应Th1细胞而言，Th2细胞则主要分泌IL-4、IL-5和IL-10等白介素因子，主要功能是刺激B细胞分泌大量的免疫蛋白，调控免疫功能的形式以参与体液免疫反应为主［11］。正常机体状态中，Th1和Th2细胞功能处于动态平衡，这两种细胞因子的表达水平一旦失衡，将会导致机体发生免疫功能紊乱及自身免疫性疾病等，保持这两种细胞因子的平衡是保障机体体液免疫和细胞免疫功能正常的重要原因［12-13］。有临床研究指出，CMV感染可导致机体Th1/Th2平衡失调，而Th1/Th2平衡状况又在CMV感染和其致病机制中具有十分重要的意义［14］。机体遭受病毒感染后，细胞因子在病毒感染过程中，可同时发挥宿主介导的病毒复制过程的参与者和病毒破坏免疫系统的重要的因子，可通过双重作用促进机体免疫功能的紊乱和自身免疫的失调。

研究显示［15］，机体遭受CMV感染后，被活化的NK细胞可产生大量的IFN-γ，可同时发挥抑制病毒复制和抑制炎性反应的双重作用，被认为是Th1亚群中抑炎作用较强的因子。IL-4作为Th2细胞亚群所分泌重要细胞因子，被认为对CMV感染的炎性反应有着重要促进作用，所以临床上常选择IFN-γ/IL-4来反映Th1和Th2的优势应答状态［16］。在本研究发现，小鼠感染MCMV后，肺组织内的IFN-γ水平明显升高，而IL-4水平则显著降低，提示Th1/Th2处于失衡状态且Th1抵抗MCMV的能力占优势地位，有利于机体通过免疫防御机制调节消除病原体。IL-4表达水水平的下降程度有限，无法发挥强大的拮抗IFN-γ分泌的作用，对IFN-γ介导的肺组织的改善作用比较有限，可认为机体免疫调节功能失衡是造成MCMV感染相关肺组织损伤加重的重要因素之一。

本研究中，应用热毒宁及更昔洛韦干预后，IFN-γ/ IL-4的值均较模型小鼠明显增大，其中IFN-γ的表达下调，IL-4水平升高，MCMV-DNA表达减少，上述指标在两治疗组的变化趋势相同，与更昔洛韦相似。热毒宁通过调节IFN-γ及IL-4的表达，纠正CMV感染所致的Th1/Th2的失衡，可能是通过诱导Th1分化，造成Th1优势反应状态，从而增强了特异性细胞免疫功能，使机体提前进入恢复期，缩短病程，更有利于机体清除病毒，减轻这些炎症因子引起的肺部炎症损伤，保护肺组织。此效应可能与热毒宁发挥抗病毒作用有关。本实验是以小鼠模型为基础，热毒宁在临床上的具体治疗作用仍需大量的临床实验来证实，同时MCMV肺炎的具体机制及信号转导通路尚待进一步的研究来明确。

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The Effect of Reduning Decoction on the Expression of IFN-γand IL-4 of Lung Tissue in Pneumonia Model M ice w ith MCMV Infection

ZHANG Wenhui，ZUO Lina，SUN Si，et al.The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Jiangsu，Xuzhou 221002，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1730-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.027

2016-04-09）

徐州医学院附属医院院内科研课题（XYFY2013018）