续断水提液对小鼠胫骨骨折愈合影响的实验研究*

武春明袁慧敏杨　迪刘　魏毛　矛

邹斌杰1，2苏　彪1，2胡伟龙1，2刘晋闽1，2

（1.浙江中医药大学，浙江　杭州310053；2.浙江省中医院，浙江　杭州310006；3．浙江省人民医院，浙江　杭州310014）

·研究报告·

续断水提液对小鼠胫骨骨折愈合影响的实验研究*

武春明1，2袁慧敏1，2杨迪3△刘魏1，2毛矛1，2

邹斌杰1，2苏彪1，2胡伟龙1，2刘晋闽1，2

（1.浙江中医药大学，浙江杭州310053；2.浙江省中医院，浙江杭州310006；3．浙江省人民医院，浙江杭州310014）

目的观察续断水提液对小鼠胫骨横行骨折愈合过程的影响。方法选用12周龄C57小鼠70只，无菌条件下实施胫骨干横形骨折髓内钉固定术，胫骨X线正侧位片剔除不合格小鼠，余下随机分为模型组、治疗组，每组再随机分为5个不同时间点。治疗组予续断水提液灌胃，模型组给予同体积生理盐水，分别于造模后第4天、7天、10天、14天、21天取样，固定后X线观察骨折愈合大体情况，Micro-CT测量ROI总体积（TV）、骨痂总体积（BV）、骨体积分数（BV/TV）和骨小梁相关参数，同时通过组织形态学HE染色评估续断水提液对小鼠骨折愈合过程的形态学影响。结果X线显示两组在骨折愈合早期（4、7、10 d）两组骨折线多较清晰，而在骨折愈合中后期（14、21 d）治疗组骨折线模糊程度高于模型组（P＜0.05）；Micro-CT显示两组间BV、BV/TV、Tb.Pf和SMI在术后14 d、21 d差异均具有统计学意义（P＜0.05），而TS两组间在各时间点差异均无统计学意义（均P＞0.05）；术后7 d和10 d时，骨痂多为软组织，14 d和21 d则逐渐向骨性转化。在术后14 d和21 d两个时间点，治疗组骨痂骨量明显多于模型组，而且治疗组骨痂的形状也更为规则，与皮质骨贴合更为紧密。结论依据X线、Micro-CT及组织形态学HE染色发现续断水提液可促进小鼠胫骨横行骨折的愈合，且其作用时间点为小鼠骨折愈合中后期。

骨折Micro-CT续断骨折

【A bstract】Objective：To explore the promoting effect of Radix Dipsaci extract on tibial fracture healing in mice.M ethods：12-week-old C57BL/6mouse were chosen for the experiment，and made a unilateral open tibiae transverse fracture with intramedullary needle fixationmodel.After the operation，They were divided into 2 groups for 5 time points random ly.The treatment group and themodel group were given Teasel rootextractand saline respectively.The samples were taken on 4th，7th，10th，14thand 21stday.3 days later，X-ray was used to observe the general situation of fracture healing，and the characteristics of bone volume of ROI（TV），volume of callus（BV），bone volume fraction（BV/TV）and Trabecular related indexes were detected with Micro-CT.At the same time，histological staining（HE）was used to assess themorphological effect of Radix Dipsaciextrac on fracture healing process ofmice.Results：X-ray showed that in the early fracture healing（4th，7th，10thday），most of fracture lines of two groupswere clear，but in the late stage of fracture healing（14th，21stday），the fuzzy degree of the treatment group was higher than that of themodel group.Micro-CT showed that there were statistical differences in BV，BV/ TV，Tb.Pf，and SMIbetween the treatment group and themodel group on 14thday and 21stday after the operation（P＜0.05）.TS showed no statistical differences among all time points.Morphological HE staining showed that 10th，14thand 21stday after operation，callus quantity，shape and direction of the treatment group were better than those of themodel group.Conclusion：Radix Dipsaci extract has a promoting effect on tibial fracture healing in mice and the promoting effect focuses on themiddle and late period.

【Key words】Fracture；Micro-CT；Radix Dipsaci

骨折是指骨的连续性与完整性被破坏，骨的机械性能超生理负荷的结果。近年来，骨折发生逐年上升［1］，骨不连、延迟愈合等骨折并发症也显著增多，严重威胁人们的健康和劳动能力［2］。因此，如何促进骨折愈合，缩短骨折愈合时间，减少患者并发症的发生，是广大创伤骨科医生非常关心的问题之一。骨折愈合是一个复杂的生物学修复过程，而中医药在治疗骨折方面历史悠久、疗效肯定，且方便易行、成本低廉、毒副作用低，已被广泛运用于骨折治疗中。本研究通过建立小鼠胫骨横行骨折模型，运用X线、Micro-CT和组织形态方法观察中药续断水提物对小鼠胫骨骨折愈合的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物健康正常12周龄C57BL/6JSPF级小鼠70只，由浙江中医药大学动物实验中心提供，合格证号：ACXK（沪）2013-0016，雌雄不拘，体质量20～25 g，饲养于浙江中医药大学动物实验中心，所有小鼠均用标准的啮齿类动物饲料喂养。实验过程对动物的处置符合浙江中医药大学实验动物伦理学标准。

1.2试药与仪器续断水提液的制备：称取续断（由浙江中医药大学药厂提供），10倍超纯水浸泡1 h后，大火煮沸后调小至微沸，以药液刚好沸腾为宜，煎熬1.5 h，反复提取3次，3次药液混合后经旋蒸仪（杭州大卫）浓缩至质量浓度0.45 g/mL后待用。戊巴比妥钠，中国医药集团上海化学试剂公司生产，批号F20020915；青霉素，华北制药股份有限公司生产，批号F3117217；络合碘，杭州朗索医用消毒剂有限公司生产，批号20150720。庆大霉素，宜昌人福药业有限责任公司生产，批号：5150126C。组织脱水机，Sakura，Tissue-Tek VIP5Jr；轮转式切片机，Thermo，HM325；全自动石蜡包埋机，Thermo，EC350-1；Micro-CT，BRUKER MICROCT N. V，型号Skyscan1176。

1.3模型制备小鼠实验前适应性饲养1周。腹腔注射0.3%戊巴比妥钠（0.2 mL/10g），待小鼠丧失意识，刮毛器刮除右侧胫骨前方体毛。小鼠取仰卧位，络合碘常规消毒，消毒面积近端达腹股沟，远端至足趾。无菌孔巾覆盖小鼠，仅暴露右后肢。沿右侧胫骨纵轴做一切口，暴露皮下组织和胫骨前缘。取27号注射器针头1枚，沿胫骨骨髓腔纵轴插入至约1/2胫骨总长度时，拔除针头。肉眼寻找胫骨前外侧向前凸起最高点，取11号刀片，在此凸起最高点后约3mm垂直缓慢戳入胫骨，刀片基本与操作台同一水平时，用小锤子垂直敲击刀片基部，直至听到“啪”声，刀片尖戳入泡沫板；移除刀片，轻轻侧方移位活动以确认骨折构建成功。取一枚25号注射器针头，复位固定；用钢丝钳横行剪断针头；络合碘消毒皮肤，间断缝合皮肤［3］。

1.4分组与给药依据术后正侧位X线片，只选择发生胫骨中部单发横形骨折的小鼠进行分组［4］，剔除不符合者后，60只小鼠随机分为两组：模型组30只，治疗组30只，每组再随机均分成4、7、10、14、21 d 5个时间段［5］。术后肌肉注射青霉素4万U和庆大霉素1万U，以预防感染，连续2 d。治疗组在术后24 h开始灌胃给药续断水提液（质量浓度4.5 g/mL，0.4 mL），模型组则给予0.4mL生理盐水灌胃，每日1次。

1.5样本采集与检测造模后4、7、10、14、21 d予0.3%戊巴比妥钠0.3mL/10 g注射处死小鼠，取整个胫骨。10%中性甲醛固定标本后，10%乙二胺四乙酸（EDTA）中性脱钙液中脱钙4周后，脱水机脱水处理，石蜡包埋，连续切取厚度为3μm组织切片，60℃烤片过夜，待制备组织切片。1）X线：取两组5个时间段的骨折样本，4%多聚甲醛固定72 h后，Skyscan1176进行X线扫描，得到骨折侧位二维图像。此外，通过3名不同的实验员（采用盲法）对X线骨折线模糊程度进行评价。2）Micro-CT：取各实验组5个时间段的骨折样本，运用Skyscan1176进行扫描分析。电压42 kV、电流555μA，滤光片Al 0.2 mm，分辨率8.73μm，扫描角度360°，获取连续的平面CT图像。选出横行骨折端上下各200张图片作为感兴趣区域（ROI），运用机载软件进行骨折端骨痂三维图像重建与分析。主要检测参数如下：骨体积（BV）、相对骨体积或骨体积分数BV/TV、骨痂表面积（TS）、骨小梁模式因子（Tb.Pf）；结构模型指数（SMI）［5］。3）HE染色：将切好的载玻片，60℃烤片2 h后进行HE染色，步骤如下：二甲苯脱蜡3次，每次5 min，之后酒精梯度脱水，脱蜡脱水完成后，纯水洗2次，每次3min，苏木精染液染色1min，纯水漂洗3次，每次3 min，PBS溶液浸泡1 min，纯水漂洗3次，每次3min，直至充分蓝化，伊红溶液染色1min，随后依次置于95%酒精3次、100%酒精2次、二甲苯3次，每次1min，中性树脂封片［6］。

1.6统计学处理应用SPSS.19统计软件。计量资料以（表示，采用t检验，组间不同时间点采用重复测量数据的方差分析。计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验，等级资料采用非参数秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1两组骨折线二维影像分析见图1，表1。通过X线获得小鼠胫骨二维图片，比较两组间骨折线模糊程度［3］，发现两组6只小鼠术后第4天、7天骨折线依旧清晰，未见任何骨性连接影像。术后第10天，两组多数小鼠骨折线依然清晰可见，但在骨痂周围可见少许骨性连接影像。术后第14天两组小鼠骨折线多数已模糊，可见较多骨性连接影像在骨痂周围。术后第21天治疗组非常模糊比例达83.33%，而模型组仍有50%的小鼠处于模糊。

图1　胫骨骨折线X线平面图

表1　小鼠骨折线模糊程度观察（n）

图2　胫骨骨折端ROI区域骨痂3D图

2.2续断提取液对骨折端骨痂形成的影响见图2。骨折端骨痂三维图像重建，从图中可以发现术后4 d，骨折端骨痂都较稀少；术后7 d骨痂的总量明显增多，多数分布在骨折端骨膜附近；而在术后第10天治疗组骨痂骨量较模型组多，且骨痂较多已经爬过骨折线；在术后14 d骨痂总量都达到峰值，治疗组中骨痂网状骨减少，可能已转化为板状骨，而模型组中仍然存在较多的网状骨痂；在术后21 d模型和治疗组骨痂均被吸收，与模型组不同，治疗组中骨痂多数已转化为致密的板状。

2.3两组Micro-CT检测参数比较见表2。通过Micro-CT分析软件进行骨痂微观结构分析，得到相关参数。从表中可见在骨折术后14 d、21 d，治疗组BV，BV/TV比值高于模型组，组间差异具有统计学意义（均P＜0.05）；而扫描区域组织TS在治疗组和模型组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；此外，Tb.Pf与SMI两组指标同样在骨折术后14 d、21 d两组间比较，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表2　两组Micro-CT检测参数比较（

表2　两组Micro-CT检测参数比较（

与模型组比较，△P＜0.05。

BV（mm3）0.12±0.03 0.63±0.05 1.53±0.13 14 d 2.78±0.17△21 d 1.60±0.12△模型组4 d 0.10±0.00（n=6）7 d 0.57±0.03 10 d 1.42±0.07 14 d 1.75±0.13 21 d 1.36±0.03组别　时间治疗组4 d（n=6）7 d 10 d BV/TV TS（mm2）0.05±0.01 85.77±4.45 0.18±0.03 76.79±1.19 0.29±0.01 71.81±1.12 Tb.Pf（mm-1）SMI 46.42±1.74 2.53±0.08 21.02±3.39 2.18±0.13 13.39±1.06 1.81±0.08 0.42±0.01△70.11±1.39 0.31±0.02△69.72±0.47 7.80±1.06△1.50±0.06△0.04±0.00 87.22±3.27 48.85±2.41 2.59±0.05 0.17±0.01 75.82±0.87 23.02±6.73 2.25±0.17 0.27±0.01 71.58±1.06 14.82±1.08 1.84±0.11 0.28±0.02 69.78±0.45 13.01±1.21 1.84±0.05 0.25±0.02 70.49±0.35 11.51±1.55 1.74±0.06 9.82±1.82△1.63±0.05△

2.4两组HE染色比较见图3。骨折术后7、10、14和21 d样本HE染色结果，考虑到骨折术后4 d组织多为血肿，在骨痂形态学上本研究在术后4 d并未进行比较。由图3可见，术后7 d和10 d时，骨痂多为软组织，14 d和21 d则逐渐向骨性转化。在术后14 d和21 d两个时间点，治疗组骨痂骨量明显多于模型组，而且治疗组骨痂的形状也更为规则，与皮质骨贴合更为紧密。

图3　两组术后7、10、14、21 d HE染色比较（50倍）

3　讨　论

骨折愈合是指骨折断端间的组织修复反应，以恢复骨的正常结构与功能，骨折愈合过程是一个复杂的组织学、生物学、内分泌学及生物力学的动态过程［7］。治疗中除采用手术、手法复位、夹板固定、练功活动等方法外，配合药物治疗也至关重要，而中医药治疗骨折主要遵循骨折3期辨证施治原则。早期，骨折移位，软组织损伤，组织充血水肿，肿胀明显，治疗主要以活血化瘀、行气止痛药物为主；中期，局部血肿吸收，水肿缓解、骨痂开始形成，而局部肿胀、疼痛仍然未尽，治疗以接骨续筋类药物为主；后期，骨折已临床愈合，但气血耗损，筋骨松软，本研究治疗以补益肝肾、强筋壮骨为主［8-9］。

续断因其续筋接骨功效而得名［10］。本品性味苦、甘、辛，微温，归肝肾经，具有补肝肾，强筋骨，行血脉，疗伤续折功效，为补肝肾疗骨伤之要药，广泛运用在骨伤科疾病治疗中，而续断具体的作用机理也被所更多关注。程志安等［10］在体外实验中，发现续断能有效促进大鼠成骨细胞增殖、分化，抑制凋亡，这也被武密山等［11］证实，此外他们还发现续断具有促进骨髓间充质干细胞增殖与向成骨细胞分化的作用。段卫华等［12］认为续断能纠正局部肿胀，促进血肿的吸收、机化，加速胶原合成，改善胶原结构和排列来加速骨折愈合。而相关临床试验也发现，续断可缩短骨折愈合时间，对老年骨折及骨折迟缓愈合有效果明显［13］，其机理是续断能促进骨折部位骨基质钙沉积，提高骨痂质量，促进相关生长因子的分泌，加快骨折愈合这一复杂的生物学过程［14］。

Micro-CT技术是一种能全面、立体、精确、无创测量骨微结构手段，可精确计量标本整体骨量参数，准确描述结构的3D分布和形态特征，可补充X线、病理切片等二维观测方法的不足［15］。Micro-CT检测中，BV、BV/TV是观察骨性骨痂的指标，是评价骨折愈合重要依据［16-17］。本研究结果表明治疗组和模型组BV、BV/ TV值随着时间逐渐升高，在术后14 d时达到高峰，而术后21 d均不同程度的降低，这可能与在骨折愈合后期骨痂的吸收有关［18］。骨折术后14、21 d治疗组BV、BV/TV比值高于模型组（P＜0.05），提示续断水提液可在骨折愈合中后节点增加骨性骨痂的生成，促进骨折愈合，这可能与补肾中药促进成骨分化相关基因的上调作用发生在骨折愈合中后节点有关［19］，这也与组织形态学染色所现一致。Tb.Pf为骨小梁模式因子提示的是骨痂内骨小梁凸凹面的程度，其值变小表示骨小梁由杆状向板状变化，力学特性增强［20］。两组在骨折术后Tb.Pf值逐渐变小，而在术后14 d、21 d治疗组Tb.Pf值显著低于模型组，说明续断水提液在小鼠骨折愈合中后期可对骨痂再塑形，恢复骨的力学特性。SMI为骨痂的结构模型指数，反映骨痂内骨小梁板状、杆状的程度，趋近于0时骨小梁多为板状，反之趋近3时骨小梁转向杆状，而在骨量减少相关疾病中SMI值常接近3［21］。在本实验中，术后第14、21天治疗组SMI均显著低于模型组，说明续断水提液在骨折愈合中后节点可使新生骨痂中力学强度较差的网状、杆状骨小梁向板状转化，而Tb.Pf、SMI值所提示的新生骨痂生物力学特性上的恢复，在HE染色中也有所体现，在术后14 d和21 d治疗组骨痂的外形、方向都趋于恢复。

综上所述，续断作为代表性的续筋接骨药，续断水提液可以增加骨性骨痂的生成，同时又可对新生骨痂再塑形，加快恢复新生骨的生物力学特性，而且这些作用主要集中在骨折愈合的中后期。

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Experimental Study on Promoting Effect of Radix Dipsaci Extract on Tibial Fracture Healing in M ice under M icro-CT

WU Chunming，YUAN Huimin，YANG Di，et al.Zhejiang Chinese Medicine University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1682-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.011

2016-06-16）

·研究报告·

浙江省中医药科技计划一般项目（2014ZB008）

（电子邮箱：Dean_yd@hotmail.com）