猪源猪链球菌耐药情况分析

张维谊，王晓旭，宁 昆，徐 锋，沈莉萍

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

猪源猪链球菌耐药情况分析

张维谊，王晓旭，宁 昆，徐 锋，沈莉萍

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

近年来，为掌握上海地区猪源猪链球菌的耐药情况及耐药规律，文章对2013～2015年畜禽门诊、养殖场、屠宰场分离到的59株猪链球菌进行药敏试验。结合CLSI及兽医临床标准，选用8种抗生素，采用微量肉汤稀释法（MIC）进行药物敏感试验。结果表明，猪链球菌对8种抗生素均产生不同程度的耐药性，且耐药程度很高在44%～95%之间，四环素耐药率最高为95%，敏感率40%以上的有4种抗生素。部分药物在临床上，已经成为严重的耐药，猪链球菌耐药情况，呈逐年加重的趋势。

猪链球菌 药敏试验 耐药性 MIC

抗生素是一类对细菌、寄生虫等具有抑制和杀灭作用的药物，在畜牧饲料行业中已得到广泛应用，在动物疫病防治、提高饲料转化效率、促进畜禽生长方面发挥了重要作用。我国由于养殖密度大，畜禽疫病复杂多样，且监管不力等多种原因，抗生素滥用现象较为严重，伴随而来的耐药问题越来越严重，给养殖业的持续健康发展埋下了隐患。

猪链球菌病是养殖业中最为常见的一种细菌性疾病。在实际养殖过程中，由于畜主对药物的滥用，使得许多常用抗菌药物出现了效果下降，甚至无效，给畜禽养殖业造成了严重的经济损失［1］。与此同时，动物养殖过程中，滥用抗生素所带来的影响，最终还是会通过各种途径“转嫁”到人身上，加剧抗生素耐药性问题，影响着人类的健康。因此，对猪源猪链球菌进行耐药性监测，掌握猪链球菌耐药规律及变化情况，对指导临床合理用药，减少养殖户经济损失具有重要意义。

该研究对近年来上海地区的猪源猪链球菌进行了细菌的分离培养和鉴定，并对分离株进行了微量肉汤稀释法药物敏感试验，研究了猪链球菌在上海地区的耐药情况，为指导养殖户临床合理用药提供参考。

1 材料

1.1 样本及标准株

2013～2015年，来自上海地区养殖场鼻棉拭子、屠宰场扁桃体样本和上海市动物疫病预防控制中心畜禽门诊接收的发病畜禽病料（心、肝、脾、肺和肾脏）。猪链球菌药敏实验质控标准株ATCC43300购买自中国兽药监察所。

1.2 主要试剂与仪器

革兰氏染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；Columbia血琼脂基础购自北京陆桥技术有限责任公司；无菌羊血购自上海闵行区诸翟无菌动物血试剂供应站；革兰氏阳性细菌鉴定卡（GP）购自法国梅里埃公司；猪链球菌药敏板（含8种抗菌药物）由天津金章科技发展有限公司订制；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；Premix购自TaKaRa公司，还有全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）和普通PCR仪（BioRad PTC-200）。

2 方法

2.1 细菌分离培养

按要求将样本涂抹接种于Columbia血平板（加入1μL/mL过滤除菌的NAD和5%～10%脱纤维绵羊血），在5%CO2培养箱中经36℃培养24～48 h，对可疑菌落进行革兰氏染色镜检。挑取单个菌落，接种于Columbia血平板进行纯培养，观察菌落特征及染色特点。

2.2 细菌鉴定

参照文献［2］合成猪链球菌的引物，PCR反应体系为25μl：premix 12.5μl、引物各0.5μl、ddH2O 8.5μl、模板2μl。反应条件为：94℃预热5 min、94℃30 s、56℃30 s、72℃1 min，扩增30个循环；72℃延伸10 min。

2.3 药敏试验

2.3.1 菌液制备

用灭菌棉签取适量待测菌，悬浮于3 ml 0.45%NaC溶液中，用比浊仪调整细菌的浓度，使其麦氏单位达到0.48～0.52。同时，用ATCC43300作为试验质控菌株。

2.3.2 菌液接种

首先从12 ml肉汤管中，吸取100μl加到空白对照孔，然后吸取待测菌液100μl到剩余的12 mL肉汤管中，混匀，加100μl到其余各孔。质控菌株操作同待测菌。

2.3.3 孵育

将药敏板置于垫有湿纱布的瓷方盘内，36℃温箱孵育16～18 h。

2.3.4 结果判定

在衬有黑底板的光线下观察，无细菌生长的孔内所含最低抗菌药物浓度，即为最低抑菌浓度（MIC）。结果判定及质量控制参照CLSI标准。

3 结果

3.1 耐药率

猪链球菌的耐药性 59株猪链球菌，对8种抗生素的药敏试验结果见表1。

3.2 多重耐药性和耐药谱

根据药敏试验结果，对猪链球菌试验菌株多重耐药性进行分析，获得其耐药谱（表2）和耐药谱型（表3），共有耐药谱型25种。

表1 59株猪链球菌MIC药敏试验结果

表2 59株猪链球菌耐药谱

表3 猪链球菌耐药谱型

3.3 猪链球菌耐药趋势

选择8种抗生素，对猪链球菌的耐药趋势进行分析（图1）。

4 分析

由59株细菌的耐药率分析，猪链球菌对8种抗生素均产生不同程度的耐药性，耐药率在44%～95%之间，耐药率80%以上的药物有2种，四环素耐药率将近95%，其余6种均在50%左右，耐药率达54.24%。敏感率40%以上的有4种抗生素，最高的仅为44.07%，头孢噻呋作为第3代动物专用头孢菌素，耐药率已达到54%以上，说明猪源猪链球菌的耐药情况严重。

耐药谱分析显示，1耐到8耐的菌株都有，最少的为3耐和4耐，其次为1耐和7耐，8耐的菌株数最多，达20%以上，仅1株菌株没有产生耐药性。该研究共出现耐药谱型25种，谱型较多，说明猪链球菌的耐药情况较为复杂，滥用抗生素较为严重，提示在临床应加强药物的合理使用和指导。

四环素和红霉素的耐药率一直居高不下，其余6种抗生素的耐药率从2013年至2015年均有增加，环丙沙星、氧氟沙星呈逐步升高趋势。头孢噻呋的耐药率从2013年的25%到2014年以来的60%，增加幅度最大。2013年，耐药率在25%有5种抗生素，到2015年，均在44%以上。

抗生素在防治畜禽疾病方面发挥了较大作用，但伴随而来的耐药问题及公共卫生问题也日益严重。加强对细菌耐药性的监测、管理和技术支持，对细菌耐药性的控制，具有重要意义。

首先是监测方面。应建立健全监测网络，提高监测水平和监测质量，保证及时、完整、准确地获得我国细菌耐药性数据，用监测结果指导养殖户，更加科学合理的使用抗生素［3］。

图1 59株2013～2015年猪链球菌不同药物耐药率

其次是管理方面。要控制和管理制药企业在畜牧养殖业中的不合理销售及竞争行为，并对基层兽医从业人员进行有效监管，加强教育培训工作，提高理论知识，防止抗生素滥用、乱用现象的发生。

最后是技术层面。临床上可以使用一些中草药，用来减少抗生素的使用。例如，金银花对耐青霉素的金黄色葡萄球菌有增敏作用，在低于抗菌浓度时，还能增强白细胞的吞噬能力，对青霉素抗菌有增效作用；葛根芪连汤与氨苄青霉素、头孢哌酮、诺氟沙星配用均有协同作用。同时，也可以探索新的抗菌治疗方法，如抗生素的轮流替用和联合用药，以应对细菌耐药性问题。

［1］ 江飙，董嘉文，张献杰，等.广东地区动物源性大肠杆菌的分离及药敏分析.中国兽药杂志，2009，43（1）：14～16

［2］ 李小军.上海地区猪链球菌致病性血清型及其毒力因子的流行病学调查.南京农业大学，2007

［3］ 刘海林，武新国.大肠杆菌的药敏试验报告.当代畜牧，2014，（11）：70～71