超声提取-高效液相色谱法同时测定新疆罗布麻茶中绿原酸和芦丁的含量

王省超, 孙 颖, 王瑞英*, 李海婷

(1.新疆大学理化测试中心，新疆乌鲁木齐830046；2.新疆产品质量监督检验研究院，新疆乌鲁木齐 830011；3.新疆大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐 830046)

罗布麻又名野麻、茶叶花，属夹竹桃科多年生灌木，主要生长在我国西北区域的沙漠盐碱等地[1,2]。罗布麻茶含有黄酮类、苯丙素类、脂肪酸醇酯和多种矿物质等成分，这对人体具有生理保健功效[3,4]。其中，芦丁在改善血液循环、预防和治疗高血压、降血脂、平肝安神、抑菌、抗氧化等方面具有显著作用[5,6]。绿原酸具有清热解毒、抗菌消炎、抗氧化等多种功效[7]，常被添加在保健食品和饮料，或用于果品保鲜。尽管目前绿原酸或芦丁的研究报道较多[8,9]，但超声法提取和HPLC法同时测定新疆罗布麻茶中绿原酸和芦丁含量的鲜有报道。

本文采用超声法提取新疆罗布麻茶中绿原酸和芦丁，考察甲醇浓度、超声功率、超声时间和料液比等因素对同时提取绿原酸和芦丁含量的影响，并设计L9(34)正交试验，优化工艺条件；建立同时测定新疆罗布麻茶中绿原酸和芦丁含量的反相高效液相色谱(RP-HPLC)法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

美国Agilent 1100型高效液相色谱系统，附四元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器。江苏昆山KQ-500 DV数控超声波清洗器(500 W,40 kHz)。美国梅特勒-多利多RT-205型电子分析天平；美国Millpore超纯水器。

绿原酸和芦丁对照品(中国药品生物制品检定所)；甲醇为色谱纯(美国Fisher)，冰乙酸为分析纯，实验用水为超纯水。

罗布麻茶购于新疆乌鲁木齐市百信大药房。

1.2 对照品及供试品溶液的配制

图1 对照品(a)和罗布麻茶样品(b)的色谱图Fig.1 Chromatograms of reference standards(a) and Apocynum venetum(b)

对照品溶液：分别精密称量对照品适量，用甲醇溶解、定容至25 mL容量瓶中，配制成含绿原酸0.173 mg/mL和芦丁0.158 mg/mL对照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存备用。供试品溶液：精密称取罗布麻茶粉末(过35目筛)1.0000 g，置于50 mL圆底烧瓶中，加入15 mL 60%甲醇溶液，超声提取2 h后定容至50 mL容量瓶中，经0.22 μm滤膜过滤，用于HPLC分析。

1.3 HPLC条件

色谱柱为Agilent TC-C18柱(150× 4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.5%冰乙酸水溶液(40∶60，V/V)；流速为1.0 mL/min，检测波长为326 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。对照品和供试品在该色谱条件下色谱图如图1所示。由图可知，新疆罗布麻茶中绿原酸和芦丁在该色谱条件下实现了良好分离。

2 结果与讨论

2.1 单因素适宜范围的确定

精确称取1.0000 g新疆罗布麻茶粉末，以甲醇溶液为提取溶剂，超声处理后定容至50 mL容量瓶中，经0.22 μm滤膜过滤，按1.3 HPLC条件进样分析，考察各单因素的影响结果。综合考虑，选择正交试验各单因素水平如下：甲醇提取溶剂(40%、60%和80%)，超声时间(40、60和80 min)，超声功率(300、400和500 W)及料液比(1∶15、1∶20和1∶25)。

2.2 正交试验结果与分析

选取甲醇浓度(A)、超声功率(B)、超声时间(C)和料液比(D)4个因素，每个因素3个水平，进行L9(34)正交试验，优化同时提取绿原酸和芦丁的条件。由正交试验分析(表 1)可知，绿原酸和芦丁的各指标受4个因素影响规律一致，即指标极差最大的是A因素，其次为B、D、C因素。由方差分析(表 2)可知，A因素差异对绿原酸和芦丁均具有显著性意义，而B、C、D因素差异对绿原酸和芦丁均无显著性意义。

表1 正交试验结果与分析

综合以上分析，超声法提取绿原酸和芦丁最佳工艺条件为A2B3C2D3，即：60%甲醇溶液，超声时间为40 min，超声功率为400 W和料液比为1∶25。

表2 正交试验结果方差分析

note：F0.05(2，2)=19.0，F0.1(2，2)=9.0.

根据正交试验结果，在最佳条件下同时提取绿原酸和芦丁，并以1.3色谱条件测定其含量。绿原酸和芦丁提取含量分别为0.71%(RSD=1.15%，n=5)和0.49%(RSD=1.68%，n=5)，与正交试验中最优水平比较相近，说明该工艺条件稳定、合理可行、可操作性强，达到工艺优化目的。

2.3 方法的标准曲线、精密度及重现性

按1.3色谱条件，分别将含绿原酸0.173 mg/mL和芦丁0.158 mg/mL的对照品溶液依次分别进样2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0和14.0 μL，得出峰面积(Y)与含量(X)的线性回归方程，分别为：绿原酸：Y=451.0214X-9.805(r=0.99993)；芦丁：Y=147.5741X-4.695(r=0.99992)。结果表明，绿原酸在0.356～2.495 μg和芦丁在0.317～2.218 μg间呈良好线性关系。

按1.2方法制备对照品溶液，重复进样5次，每次10 μL，按1.3色谱条件测定绿原酸和芦丁的峰面积，并计算相对标准偏差(RSD)。对照品绿原酸和芦丁的RSD(n=5)分别为0.27%和0.73%，表明本方法精密度良好。精密称取5份1.0000 g的罗布麻茶粉末，按1.2方法制备供试溶液，分别测定峰面积，绿原酸和芦丁的RSD(n=5)分别为1.82%和1.81%，表明本方法重现性良好。

2.4 回收率及稳定性实验

精密称取6份1.0000 g的罗布麻粉末，分别加入不同体积的同一对照品溶液，按1.2制备供试溶液，并进样分析，计算回收率。结果表明，绿原酸和芦丁的平均加标回收率分别为103.41%(RSD=0.79%，n=6)和99.68%(RSD=0.69%，n=6)。

取同一供试品溶液，在24 h内每隔2 h按上述色谱条件进样分析，测定绿原酸和芦丁的峰面积，其RSD分别为1.06%和1.80%，结果表明供试品溶液中绿原酸和芦丁在24 h内稳定。

3 结论

本文对新疆罗布麻茶中绿原酸和芦丁的超声法提取工艺进行优化，并建立了简便、快速且同时测定绿原酸和芦丁含量的HPLC法。实验结果表明，经优化的工艺能显著提高绿原酸和芦丁提取量，适合新疆罗布麻茶中绿原酸和芦丁含量的同时测定。