猪肝样品中莱克多巴胺测定的前处理方法

2016-10-16陈海玲谢维平

分析科学学报 2016年3期

陈海玲，谢维平

(1.泉州医学高等专科学校，福建泉州 362100；2.泉州市疾病预防控制中心，福建泉州 362018)

莱克多巴胺(Ractopamine)作为主要的β2-受体激动剂，它能够改善动物养分的代谢途径，提高胴体瘦肉率[1]。由于其易在动物肝脏中积聚残留，并可通过食物链进入人体，人食用后可能出现心跳加快、震颤、心悸等症状，严重危害人类健康。因此，研究苯克多巴胺的分析方法十分重要。目前，动物源性食品中瘦肉精检测方法很多，主要有国家标准方法[2]、行业标准方法[3]和文献报道方法[4]等。这些方法均采用高效液相色谱-串联质谱技术，能准确测定目标物，但样品的前处理步骤过于复杂，使得检验效率低，不能实现对动物源性食品的快速监测。

β2-受体激动剂易在动物肝脏中积聚残留，所以本方法主要对猪肝样品中莱克多巴胺残留检验的前处理步骤进行简化，以提高检测效率，建立的方法可达到国家标准的要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪(美国，Agilent公司)，配有电喷雾离子源，AB SciEX API 4000+；DC-12氮吹仪(上海安谱)；GL-20G -Ⅱ高速冷冻离心机(上海安亭)；A-1000S固相萃取装置(日本，EYELA)；MCX固相萃取柱(60 mg/3mL，德国CNW)。

盐酸莱克多巴胺标准溶液：准确移取1.00 mL的盐酸莱克多巴胺标准品(农业部环境保护科研环境监测所)，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，制成10 μg/mL的标准储备液。氨化甲醇溶液：移取10.0 mL氨水于250 mL容量瓶中，用甲醇定容，混合均匀。甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 仪器工作条件

液相色谱条件：色谱柱为Waters ATLANTICS C18柱(150×2.1 mm i.d.，5 μm)；流动相A为0.1%甲酸/水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0 min 95%A;1.0～5.0 min,95%～55%A;5.0～5.2 min,55%～95%A;5.2～10.0 min,95%A。流动相流速为0.3 mL/min；柱温为35 ℃，进样量为10 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应监测(MRM)模式。喷雾电压(IS)5 500 V，辅助气温度(TEM)600 ℃，进样锥孔盘加热器(ihe)设置为on，雾化气(GS)压力为50 kPa，辅助气(GS)压力为50 kPa，气帘气(CUR)压力为35 kPa，碰撞室(CAD)气体压力为6 kPa。Ract的MRM离子对及质谱条件见表1。

表1 多反应监测离子对及质谱条件

1.3 样品提取及净化

将洗净、除去表面水分并剔除组织等杂质的猪肝样品切小块，准确称取100.00 g于料理杯中，或加入100 μL 10 μg/mL莱克多巴胺溶液充分搅碎，制得猪肝样品或莱克多巴胺含量为10 μg/kg的加标样品。准确称取2.00 g已制备好的猪肝样品或加标样品于50 mL离心管中，加入20 mL 0.1 mol/L HCl，漩涡5 min，充分混匀，超声提取10 min后，加入200 μL HClO4(70%～72%)，漩涡混合均匀，4 ℃、8 000 r/min离心10 min。将上清液倒入另一50 mL离心管中，加入10 mL正己烷，在振荡器上振荡10 min，4 ℃、8 000 r/min离心10 min。弃去正己烷和乳化层，取下层液体10.00 mL于活化好的MCX交换柱上[1]，控制流速约1 d/10s。然后依次用水3.0 mL和甲醇-水(1+1)溶液3.0 mL淋洗柱子。淋洗完全后，抽真空3 min。以3.0 mL氨化甲醇溶液洗脱，温度40 ℃水浴下用氮气吹至近干，残渣用甲醇定容至1.00 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，在仪器工作条件下测定。

2 结果与讨论

2.1 高氯酸的作用

肉制品的主要成分是蛋白质和脂肪，在样品提取和纯化过程中除去主要干扰成分蛋白质和脂肪至关重要[5]。而采用阳离子交换固相萃取柱检测β2-受体激动剂时，必须调节样品的pH值以达到被测物在水相或有机相分配的目的，但存在被测物被吸附等缺点[6]。本实验在酸解的同时加入少量HClO4，一方面可以沉淀蛋白质，另外可以水解一部分脂肪，同时使测定的目标物在酸性条件下离子化，增大溶出率和提取效率，而不需要特意调节pH值，简化了操作步骤。

2.2 酸解与酶解的对比

β2-受体激动剂在动物体内代谢过程中会在葡萄糖醛苷、硫酸酯蛋白等作用下发生各种轭合反应，生成的轭合物将长期存在[7,8]，必须破坏这种结构使之游离出来才能进行测定。国家标准方法[2]及文献报道的方法[7 - 9]中动物源性食品常用酶解法，即用β-盐酸葡萄糖醛甙酶-芳基硫酯酶，本文采用HCl酸解，实验将两种方法进行比较，结果表明，两种方法回收率相差不大，均能符合分析方法的要求。但酶解法成本昂贵且前处理步骤过于复杂，检验效率低，增加了大量肉制品检验和风险监控的难度。不能及时反映猪肉质量或市场情况。

2.3 猪肝样品对莱克多巴胺吸附时间对吸附率的影响

实验考察阴性猪肝样品对莱克多巴胺吸附时间对提取效率的影响。按上述方法制备加标样品后，实验考察了吸附时间为0、1、2、12、24、36 h后，酸的提取效率，结果表明，不同吸附时间下，平均回收率在75%～80%。这说明吸附时间对回收率的影响并不大，HCl均能够有效提取猪肝样品中的莱克多巴胺。所以，后续实验选择吸附时间为0 h，即猪肝样品加标后马上用酸提取。

2.4 酸的种类对提取效果的影响

按上述方法，实验考察了浓度均为0.1 mol/L的HCl、H2SO4、HNO3、H3PO4、HClO4和三氯乙酸对提取效果的影响。实验发现，对于莱克多巴胺含量为10 μg/kg的猪肝样品，H3PO4和三氯乙酸提取的回收率相对较低，分别是56.7%和53.5%，且用三氯乙酸提取后样品杂质峰相对较多。用HCl、H2SO4、HNO3、HClO4提取效果相近，回收率分别为77.6%、75.4%、74.6%和76.0%。用HCl和HNO3提取时，加入200 μL HClO4溶液(70%～72%)后，可沉淀猪肝样品中的蛋白质，使样品初步净化。实验选择HCl用来提取猪肝中的莱克多巴胺。

2.5 酸的浓度、提取时间等因素对提取效果的影响

对莱克多巴胺含量为10 μg/kg的加标样品，实验采用正交试验L16(45)对酸的浓度、提取时间、提取温度和HClO4用量进行考察，每个样品号平行测定3次。正交试验表见表2。

表2 L16(45)正交设计试验表

实验发现，当HCl浓度≥0.2 mol/L，HClO4体积≥100 μL时，方法的回收率在80%～110%之间，符合食品分析方法的要求。为了使提取方法简便易行，提取溶液澄清易过柱，尽可能使方法回收率高，选择HCl浓度为0.2 mol/L、提取时间为40 min、提取温度为25 ℃、高氯酸用量为200 μL为最佳提取方法。