混合模式固相萃取吸附剂的制备与应用

金淑培， 邢 钧

(生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

1 引言

尽管现代分析仪器在精密度和灵敏度等方面取得了长足的进步，但在面对复杂体系中痕量或超痕量组分的分析，以及大量共存组分的干扰时，直接使用分析仪器测定往往存在困难[1]，因此，通常需要在分析测定前对样品进行前处理，以达到样品净化及目标物分离与富集等目的。液液萃取[2]、柱色谱、索氏提取[3]等传统的样品前处理方法，由于存在有机溶剂消耗量大、样品分析时间长、操作步骤繁琐及易造成目标物损失等缺点，已逐渐被固相萃取[4,5]、固相微萃取[6,7]、超临界流体萃取[8,9]、微波辅助萃取[10,11]、膜萃取[12]以及加速溶剂萃取[13,14]等新的前处理方法所取代。其中，固相萃取(Solid-phase Extraction，SPE)技术因其具有回收率高、有机溶剂消耗少、重现性好、操作简便以及易于自动化等优点，已成为目前应用最广泛的一种样品前处理技术，并在环境监测[15]、食品安全[16]、药物研发[17]等领域获得了广泛的应用。

2 固相萃取吸附剂

2.1 固相萃取及其吸附剂

固相萃取是利用固体吸附剂与样品溶液中目标物的相互作用，使目标物保留在吸附剂上，从而达到分离目的的一种样品前处理技术。固相萃取操作大致包括以下几个步骤，即吸附剂活化；上样；清洗及洗脱。根据使用的目的不同，固相萃取可分为两种操作模式：目标分析物萃取模式和杂质萃取模式。由于固相萃取的选择性取决于吸附剂与目标物间相互作用的特异性，因此，目标物导向的吸附剂研究一直是固相萃取技术研究的核心内容。经过分析工作者多年的不懈努力，目前已经发展出众多选择性各异的固相萃取吸附剂。按照与目标物之间作用模式的多少，吸附剂大致可分为单一模式吸附剂和混合模式吸附剂两类。

单一模式吸附剂包括正相吸附剂、反相吸附剂和离子交换吸附剂。正相吸附剂的特点是吸附剂结构中含有羟基、氨基、氰基等极性官能团。它可与目标物发生氢键、偶极-偶极作用等相互作用，常用于从非极性基质中萃取分离极性物质[18,19]。反相吸附剂的特点是含有长链烷基或苯基等非极性官能团，如C18键合硅胶和聚苯乙烯-二乙烯苯微球。这些吸附剂主要通过疏水作用使目标物得以保留，常用于从水样中分离非极性到中等极性目标物[20,21]。离子交换吸附剂的特点是含有离子交换基团，其保留机理是吸附剂与目标物之间的离子交换作用[22,23]。由于这些吸附剂与目标物之间的作用相对单一，在面对复杂样品的分析时常会遇到干扰组分难以去除、回收率低等问题[24]。

图1 基于硅胶(A)和聚合物(B)基质的混合模式吸附剂Fig.1 Silica-based(A) and polymer-based(B) mixed-mode SPE sorbents

混合模式吸附剂的特点是同时含有两种或两种以上作用机理不同的官能团，可与样品中的目标物同时发生两种或两种以上的相互作用。典型的混合模式吸附剂一般同时具有疏水作用和离子交换作用[25]，其结构示意图见图1。根据吸附剂上所含离子交换基团的种类和离子交换作用力的强弱，混合模式吸附剂又分为混合模式强/弱阳离子交换吸附剂和混合模式强/弱阴离子交换吸附剂[26]。表1列出了一些常见的商品化混合模式吸附剂。

2.2 混合模式吸附剂的优势

混合模式吸附剂通常具有疏水和离子交换基团，因此，不仅可以通过调节洗脱溶剂的洗脱强度控制吸附剂对目标物的保留行为，而且可以通过控制上样溶液和洗脱溶剂的pH来调控吸附剂对目标物的保留行为。这一特点使得混合模式吸附剂在复杂样品的前处理中表现出比单一模式吸附剂更好的选择性。

表1 常见的商品化混合模式吸附剂

1polyvinylpyrrolidone-divinylbenzene；2polystyrene-divinylbenzene.

图2 空白尿样直接进样(a)、加标尿样经Cleanert C18(b)和DF-KIT-6(c)固相萃取后所得色谱图[27]Fig.2 Chromatograms of blank urine(a),spiked urine sample after C18-based SPE(b)，and after DF-KIT-6-based SPE(c)[27]

图3 使用串联吸附剂的固相萃取流程图[28]Fig. 3 Outline of the SPE procedure using tandam sorbents in series[28]

Li等[27]合成了具有苯基和季胺基的反相/强阴离子交换吸附剂DF-KIT-6，建立了固相萃取-高效液相色谱/紫外检测联用的方法，用于测定人体尿样中的非甾体抗炎药酮基布洛芬(KEP)、萘普生(NAP)和布洛芬(IBU)。这三种非甾体抗炎药的pKa值为4.15～4.91，因此，可以通过控制上样溶液的pH为7.0，使目标分析物的羧基大部分处于去质子化状态，利用疏水作用和阴离子交换作用使这些药物保留在DF-KIT-6柱上。然后，依次用磷酸盐缓冲液(pH=7.0)和乙酸乙酯清洗，可分别除去尿样中水溶性的和通过疏水作用保留的共萃取干扰物，但目标分析物不会被洗脱下来，从而实现对目标分析物的选择性分离。图2是分别采用单一模式吸附剂Cleanert C18和混合模式吸附剂DF-KIT-6对尿样进行固相萃取的色谱图。不难看出，混合模式吸附剂DF-KIT-6不仅能更有效地去除尿样中的干扰物，而且萃取效率更高。

另一方面，当样品中含有不同种类的目标分析物时，可采用不同种类混合模式吸附剂组合的方法，通过优化上样和洗脱条件，实现多类别目标物的同时萃取、分类洗脱。Laven等[28]串联使用两支装填不同混合模式吸附剂的SPE柱(疏水/强阳离子交换的Oasis MCX和疏水/强阴离子交换的Oasis MAX)，研究了废水中15种酸性、中性及碱性药物的同时富集和分类分离，其流程见图3。结果表明，这种串联双柱不仅有利于增加萃取目标物的个数，而且通过分类分离能够显著降低流出液的复杂性，明显降低质谱分析的基质效应。

3 混合模式吸附剂的制备

从吸附剂基质角度看，混合模式吸附剂的基质有两种，即硅胶基质和有机聚合物基质。这两种基质其实都不完美，既有各自的优点，同时也有基质本身所决定的无法克服的缺陷。硅胶基质具有多孔性、易于传质、机械性能高、有机溶剂耐受性好的优点，而且硅胶表面的硅羟基易于修饰。但硅胶基质的吸附剂只能在pH2.0～7.5范围内使用，适用的pH范围较窄。有机聚合物基质虽然对强酸强碱的耐受性好，可在极端pH条件下使用，而且聚合物基质本身还能与目标物发生疏水相互作用。但是聚合物基质对有机溶剂的耐受性较差，而且后续修饰的难度较大。

3.1 硅胶基质混合模式吸附剂的制备

制备硅胶基质混合模式吸附剂的途径主要有两条，一是直接通过硅烷偶联剂与硅胶表面硅羟基的反应引入疏水基团(如C8、C18)和具有反应活性的官能团(如-Cl、-CN或-SH)，然后利用取代反应、水解反应或氧化反应等衍生化反应使活性官能团转化为离子交换基团。二是近年出现的基于“点击化学”(Click Chemistry)的新制备途径。

Cai等[29]将十八烷基三氯硅烷与3-氰基丙基三氯硅烷两种硅烷偶联剂以摩尔比1∶2和硅胶回流反应，反应完成后所得产物再于30%的硫酸/甲醇混合液中进行水解反应，得到表面键合C18和羧基(-COOH)的混合模式吸附剂C18WCX。Li等[30]利用正十八烷基三氯硅烷和2-(4-氯磺酰苯基)乙基三氯硅烷与硅胶反应，然后再进行水解反应，得到含有C18和磺酸基(-SO3H)的混合模式吸附剂RP18/SCX。该途径的优点是相关合成方法较为成熟，其缺陷是：由于商品化硅烷偶联剂种类不多，可制备的吸附剂种类非常有限。

“点击化学”的慨念是由诺贝尔化学奖获得者Sharpless[31]于2001年提出的，其特点是：(1)反应条件温和，对水和空气不敏感；(2)反应原料和试剂易得；(3)立体选择性好；(4)产率高，无副产物；(5)产物分离提纯容易。目前应用最广泛的点击反应是Cu(I)催化的端炔-叠氮环加成反应(CuAAC)和巯基-烯基加成反应。自点击化学的概念提出至今，点击化学在表面修饰[32]、功能聚合物合成[33]、DNA标记[34]、生物大分子[35]、化学传感器[36]等方面取得了瞩目的成果。由于商品化的端炔基、巯基化合物品种很多，因此将点击反应用于混合模式吸附剂的制备，有望提高制备混合模式吸附剂的反应效率，增加混合模式吸附剂的种类，扩大混合模式吸附剂的应用范围。Zhu等[37]通过单次CuAAC点击反应将不同比例的1-十二炔和5-己炔酸同时键合到叠氮硅胶表面(图4)，制备了一种表面同时具有长链烷基和羧基的反相/弱阳离子交换混合模式硅胶吸附剂(silica-WCX)。该方法不仅操作方便，而且通过控制1-十二炔与5-己炔酸的投料比，能够准确控制吸附剂中疏水基团与离子交换基团的比例。将silica-WCX作为基质固相分散吸附剂，可用于萃取检测猪肝中的克伦特罗和莱克多巴胺。与商用吸附剂Oasis WCX比较，silica-WCX对猪肝样品的净化效果更好。除了用于制备SPE混合模式吸附剂，点击反应还成功用于制备混合模式色谱固定相(包括反相/离子交换[38]、亲水/离子交换[39]、反相/亲水[40]、两性离子[41]等多种类型)以及整体柱材料的功能化[42]。

图4 单次CuAAC点击反应合成silica-WCX的示意图[37]Fig.4 Preparation scheme of silica-WCX via single-step CuAAC click reaction[37]

图5 HXLPP-WAX-EDA、HXLPP-WAX-piperazine(A)[46]和HXLPP-SCX(B)[47]的合成示意图Fig.5 Preparation schemes of HXLPP-WAX-EDA,HXLPP-WAX-piperazine(A)[46] and HXLPP-SCX(B)[47]

3.2 聚合物基质混合模式吸附剂的制备

早期的混合模式聚合物吸附剂主要是以具有大孔结构的聚乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯(PVP-DVB)或聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)微球为基础发展起来的，这类吸附剂对极性大的目标分析物保留较弱[43]，而且吸附容量不高。上世纪末，Davankov等[44]提出了“超高交联聚合物”的慨念，Veverka等[45]则研究了基于氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的超高交联反应机理，即通过氯甲基的Friedel-Crafts反应使聚合物链进一步交联。利用“超高交联方法”制备的聚合物微球，粒径更小(约为5 μm)，表面积高达1 000 m2/g，吸附容量可得到大幅提升。目前常用于混合模式聚合物吸附剂的共聚物合成。

Fontanals等[46]用单体4-氯甲基苯乙烯(VBC)和交联剂二乙烯苯(DVB)通过沉淀聚合法得单分散聚合物微球VBC-DVB，然后又用FeCl3做催化剂经Friedel-Crafts反应得表面含有氯原子的超高交联聚合物(HXLPP)。HXLPP分别和乙二胺和哌嗪反应得混合模式弱阴离子交换吸附剂HXLPP-WAX-EDA 和HXLPP-WAX-piperazine(图5A)。以环境样品中的酸性和碱性药物为探针分子对这两种吸附剂的萃取性能进行评价，结果表明两种吸附剂的萃取性能优于商用吸附剂Oasis WAX和Strata-X-AW。Fontanals等[47]在HXLPP的基础上，使用磺化剂制得含有磺酸基的混合模式强阳离子交换吸附剂HXLPP-SCX(图5B)。

4 混合模式吸附剂的应用

4.1 在环境分析中的应用

Zhu等[48]使用自制的混合模式弱阳离子交换吸附剂silica-WCX对水中芳香胺进行萃取分析。结果发现在pH值为5.0时上样，依次用pH=5.0的磷酸盐缓冲液和正己烷清洗SPE柱，最后用NH4OH-MeOH(5∶95，V/V)作为洗脱溶剂对芳香胺的萃取效果最佳，结合高效液相色谱-紫外检测器分析，目标分析物的回收率在75%～98%间，检出限范围为0.08～0.28 μg/L。

图6 污水样品经HLB和WCX柱的色谱图[49]Fig.6 Typical chromatograms of wastewater samples after SPE with HLB and WCX cartridges[49]

He等[49]使用Oasis WCX柱结合高效液相色谱-荧光检测器测定城市污水中的11种氟喹诺酮抗生素。当样品溶液的pH为3.0时，目标分析物通过疏水和阳离子交换作用被Oasis WCX柱保留，用甲醇作为清洗液，最后使用甲醇-乙腈-甲酸(20∶75∶5，V/V/V)洗脱目标分析物。实验对Oasis WCX与Oasis HLB柱的净化效果进行了比较，从图6可以看出，经Oasis HLB柱净化后的色谱图由于干扰物去除不充分，基线噪音大，影响目标分析物的检测；而经Oasis WCX柱净化后的色谱图无干扰峰。所有氟喹诺酮抗生素检出限在0.3～1.5 ng/L之间。

Casado等[50]使用混合模式强阳离子交换吸附剂Oasis MCX，建立了一种固相萃取-液相色谱/四极杆飞行时间质谱同时测定水中碱性抗真菌药物的分析方法。与Oasis HLB吸附剂相比，Oasis MCX吸附剂可选择性吸附目标分析物，并可以使用有机溶剂有效除去干扰物，因此在质谱分析时没有看到明显的基质效应。所建立方法的定量限范围为2～15 ng/L。

4.2 在食品分析中的应用

Xia等[51]用混合模式强阴离子交换吸附剂Oasis MAX同时萃取牛奶中的6种玉米赤霉醇类化合物，用3 mL酸化乙腈洗脱目标分析物，最后用超高效液相色谱-串联质谱仪检测。目标分析物的检出限和定量限的范围分别为0.01～0.05 μg/L和0.05～0.2 μg/L。所建立方法的日内和日间相对标准偏差分别小于8.7%和10.9%。Zhao等[52]建立了测定植物油中异黄酮类和白芦藜醇类的固相萃取-高效液相色谱/串联质谱检测方法。油样用正己烷稀释，Oasis WCX固相萃取柱净化。所有目标分析物的回收率大于79.2%。

4.3 在药物分析中的应用

Boonjob等[53]分别使用混合模式离子交换吸附剂Oasis MAX、Plexa PAX、Oasis MCX和Plexa PCX对尿中6种β-受体阻滞剂进行固相萃取。实验对比了这4种吸附剂对目标分析物的萃取效果，结果表明，Oasis MCX和Plexa PCX的萃取效果优于Oasis MAX和Plexa PAX。这是因为β-受体阻滞剂为碱性目标物，在碱性环境下不会电离，而在弱酸性环境下容易被离子化为带正电荷的阳离子。所以碱性样品溶液中的6种β-受体阻滞剂和Oasis MAX、Plexa PAX间不产生阴离子交换作用。而当样品溶液pH值为3.0时，目标分析物通过疏水作用和阳离子交换作用而保留在Oasis MCX和Plexa PCX柱上。

Xu等[54]使用自制的含有苯基和磺酸基的混合模式吸附剂HXLPP-SCX对人血清中3种碱性嘌呤代谢物6-羟基嘌呤、2，6-二羟基嘌呤和肌苷进行纯化分析。HXLPP-SCX表现出良好的选择性和吸附能力。6-羟基嘌呤、2，6-二羟基嘌呤和肌苷的检出限分别为4、6、18 ng/mL。

Pelição等[55]用混合模式强阳离子交换吸附剂Bond Elut Certify测定全血中可卡因、安非他命和大麻类物质。用丙酮-二氯甲烷(1∶1，V/V)可洗脱中性和酸性目标物，而碱性目标物则用乙酸乙酯-氨水(98∶2，V/V)洗脱。所建立方法的日内和日间相对标准偏差分别小于14.9%和18.4%。

除了在环境、食品和药物分析等领域有应用外，混合模式吸附剂在生命科学[60，61，63]、司法鉴定[62，64]领域也受到了广泛的关注。表2列举了混合模式固相萃取吸附剂的一些应用实例。

表2 混合模式吸附剂的应用

5 总结与展望

在复杂样品前处理中，混合模式吸附剂可综合发挥疏水作用、离子交换作用、氢键等多种相互作用，因此，表现出比单一模式吸附剂更好的选择性。尽管有关混合模式吸附剂的研究工作已取得了许多重要的进展，我们认为以下几个方面的研究值得特别关注：基于构效关系的高选择性吸附剂设计方法；借鉴有机合成化学的研究成果，多官能团的同步、高效引入方法；兼具极端酸碱环境及有机溶剂耐受性，并且便于化学修饰的新型吸附基质。