呋喃妥因分子印迹电化学传感器的制备及应用

2016-10-16谭学才杨素平黄翠玉吴佳雯李晓宇李鹏飞余会成李小燕雷福厚

分析科学学报 2016年1期

胡琪，谭学才，杨素平，黄翠玉，吴佳雯，李晓宇，李鹏飞，余会成，李小燕，雷福厚

(广西民族大学化学化工学院,广西林产化学与工程重点实验室,广西高校食品安全与药物分析化学重点实验室，广西南宁 530008)

呋喃妥因(Nitrofurantoin,NTF)是抗菌类药物，广泛应用于尿道细菌感染。目前，检测NTF的主要方法有分光光度法[1,2]，原子吸收法[3]、高效液相色谱法[4 - 6]、极谱法[7]、光纤传感器[8]和电化学伏安法[9]等。电化学检测与分子印迹技术[10,11]结合能很好的解决灵敏度、选择性的问题。本文利用自制的马来松香丙烯酸乙二醇酯(EGMRA)为交联剂，以甲基丙烯酸为功能单体，NTF为模板分子，制备分子印迹聚合膜，采用差分脉冲伏安(DPV)法测定，实现了对NTF肠溶片样品中NTF的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI760D电化学工作站(上海辰华仪器公司)，三电极系统：玻碳电极(GCE，Φ=3.0 mm)、印迹或非印迹电极为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂柱电极为对电极；DZF-6021型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

NTF(分析纯，中国药品生物制品检定所)；呋喃西林(分析纯，中国药品生物制品检定所)；盐酸氨基脲、呋喃它酮、呋喃唑酮均为分析纯，购买于阿拉丁试剂公司；甲基丙烯酸(分析纯，Sigma公司)；马来松香丙烯酸乙二醇酯(EGMRA，自制)，其余试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 印迹及非印迹电极的制备

在25 mL烧杯中加入适量9∶1的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醇，称取0.1 mmol NTF模板分子，然后依次加入0.4 mmol的甲基丙烯酸、0.8 mmol EGMRA和0.0072 g偶氮二异丁腈(每加入一种试剂均超声溶解5 min)。取2 μL NTF溶液滴涂于预处理好的裸电极表面，将该电极放入60 ℃真空干燥箱内反应4 h。将热引发聚合后的电极置于DMF-甲醇-乙酸(8∶1∶1，V/V)溶液中洗脱，直至洗脱之后的印迹电极峰电流不变，将印迹电极(MIP)保存于水中待用。非印迹电极(NIP)的制作除不加模板分子外，其余步骤同上。

1.3 检测方法

采用循环伏安(CV)法、差分脉冲伏安(DPV)法、交流阻抗(EIS)法对印记电极进行表征。测定溶液为5.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]-0.10 mol/L KCl(pH=4.0)，实验所用溶液均需通氮气除氧处理。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1模板去除溶剂及洗脱时间的选择分别考察了体积比为3∶7、4∶6、5∶5的DMF-水溶液，体积比为5∶4∶1的DMF-乙酸-水溶液，体积比为1∶9、2∶8的乙酸-甲醇溶液，体积比为8∶1∶1的DMF-乙酸-甲醇溶液。结果发现，体积比为8∶1∶1的DMF-乙酸-甲醇溶液可快速有效地去除模板分子。实验选择10 mL体积比为8∶1∶1的DMF-乙酸-甲醇溶液为去除模板的洗脱剂。对印迹电极进行磁力搅拌洗脱，结果发现，随洗脱时间不断增加，NTF溶出而留下的“空穴”就越多，探针峰电流就越大。当洗脱50 s后，K3[Fe(CN)6]峰电流变化并不显著，表明聚合膜中的NTF已全部溶出。故选择50 s为最佳的洗脱时间。

2.1.2支持电解质pH的选择在0.10 mol/L KCl溶液中加入不同体积的0.10 mol/L HCl或0.10 mol/L NaOH溶液调节其pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。实验结果表明，碱性太强会破坏印迹膜的稳定性导致模板分子的识别能力下降。实验结果发现，当溶液的pH值为4.0时，峰形较为理想，而且响应电流最大。因此选择测试底液的pH值为4.0。

2.1.3孵化时间的选择实验结果表明，随着孵化时间从5 s逐渐增加到60 s时，印迹传感器对探针分子的氧化峰电流不断地降低。这表明随着孵化时间的增加，模板分子与印迹膜中的“空穴”能重新结合，导致洗脱之后的印迹电极表面的“空穴”被封闭。当孵化时间超过60 s时，峰电流变化趋于平衡，说明NTF分子在印迹膜中的识别能力已经饱和，故选用60 s为最佳孵化时间。

2.2 分子印迹膜电化学表征

2.2.1不同电极的循环伏安图和差分脉冲伏安图图1是裸GCE(a)、去除模板分子后的印迹电极(b)、加入1.5×10-6mol/L NTF与印迹电极作用后(c)、加入2.0×10-6mol/L NTF与印迹电极作用后(d)、非印迹电极(e)的CV图及DPV图。由图可知，探针分子在裸GCE上有较大的峰电流；去除模板分子后，印迹电极表面形成了印迹“空穴”，使电化学传感器上出现了小于裸GCE上的峰电流；然而加入不同浓度的NTF与印迹电极作用后，NTF会进入空穴中，从而阻碍探针分子的电子传递速率，高浓度的NTF扩散能快速结合从而阻碍就更大；而在洗脱之后的非印迹电极的表面不会出现印迹空穴，因而洗脱之后的非印迹电化学传感器上基本上没有峰电流出现。

图1 不同电极在5.0×10-3 mol/L [Fe(CN)6]-3/-4(含0.1 mol/L KCl,pH=4.0)中循环伏安图(A)及差分脉冲伏安图(B)Fig.1 Cyclic voltammograms (A) and different pulse voltammograms (B) of different modified electrodes in 5.0×10-3 mol/L [Fe(CN)6]-3/-4 solution containing 0.1 mol/L KCl(pH=4.0)the bare GCE(a),after removal of the NTF(b),after interaction with 1.5×10-6 mol/L NTF(c),after interaction with 2.0×10-6 mol/L NTF(d) and nMIPs-electrode(e).

图2 不同电极的交流阻抗图Fig.2 Electrochemical impedance spectroscopy of different modified electrodes the bare GCE(a),after removal of the NTF(b),after interaction with 5.0×10-6 mol/L NTF(c),after interaction with 8.0×10-6 mol/L NTF(d),after interaction with 5.0×10-5 mol/L NTF(e) and nMIPs-electrode(f).

2.2.2不同电极的交流阻抗图图2是不同电极的交流阻抗(EIS)图。从图中可以看到，裸GCE的EIS半圆直径非常小，表明对探针分子有很小的电子转移阻抗；印迹电极去除模板分子后，会形成了“空穴”但其非孔穴部分会覆盖电极表面，从而使电极的阻抗值有所增大；在印迹电极测试时候，加入不同浓度的NTF，NTF模板分子会和印迹膜孔穴发生识别，从而封闭印迹“空穴”，高浓度的模板分子能快速和印迹膜发生结合，因而使电极的阻抗值出现不同的情况；洗脱之后的非印迹电极的阻抗变化表明，洗脱之后的非印迹电极表面不能形成印迹孔穴，从而使电化学传感器的阻抗值最大。这与图1中的CV图十分吻合。

2.2.3传感器的响应特征实验结果表明(图3)，在8.0×10-8～5.0×10-6mol/L浓度范围内，[Fe(CN)6]3-/4-氧化峰电流与NTF的浓度呈良好的线性关系，其线性回归方程为:ip(μA)=10.209-0.0186c(10-8mol/L)，相关系数为0.9939，检出限为6.5×10-8mol/L。该传感器具有更高的灵敏度，且制作简便价格低廉。

2.2.4传感器的选择性实验考察了印迹和非印迹传感器的选择性。由图4可知，NTF在印迹电极上的响应电流(△i)最大，对NTF分子有较好的识别的能力。而非印迹电极在NTF及其类似物中响应电流(△i)均非常小且差别不大,表明非印迹膜电极不具备特异性识别能力。

图3 不同浓度NTF的差分脉冲伏安图(内插图为峰电流与NTF浓度的校正曲线)Fig.3 Different pulse voltammograms of different NTF concentration；Inset shows the linear relation between peak current and the concentration of NTF NTF concentrations are 8.0×10-8,5.0×10-7,8.0×10-6,1.0×10-6,2.0×10-6,3.0×104,4.0×10-6 and 5.0×10-6 mol/L(from up to low),respectively.

图4 印迹膜电极和非印迹膜电极对不同物质的选择性响应Fig.4 The selective response of the MIP and NIP electrochemical sensors to NTF(a),furaltadone(b),furazolidone(c),furacilinum(d),semicarbazide hydrochloride(e) with the same concentration of 1.0×10-6 mol/L

2.2.5传感器的重现性和稳定性用同一根电极对1.0×10-8mol/L的NTF溶液平行测定20次，其相对标准偏差为1.9%，说明该传感器的重现性较好。将使用过的电极用洗脱液重新洗涤，然后将其保存于水中，47 d后进行测试，其响应电流下降了3.3%，说明了该传感器的稳定性良好。