基于密度泛函理论的橘霉素衍生物质谱裂解行为研究

宋小平，罗由萍，陈光英，牛燕燕

(海南师范大学化学与化工学院，海南海口 571158)

密度泛函理论(Density Functional Theory，DFT)是一种研究多电子体系电子结构的量子力学方法，从有机物离子中电子分布和转移规律、能量角度出发，计算分析化合物的结构及性质，解析化合物在质谱中的裂解机理和裂解规律，为预测未知化合物的结构和裂解方式提供理论基础。现在已有越来越多的质谱学家应用该方法优化离子结构，并预测可能的质谱裂解机理[1 - 3]。

橘霉素是真菌的次级代谢产物，在变质的水果、受潮的粮食中都可能存在，对人畜和植物有毒害作用。有研究[4,5]表明，橘霉素具有神经毒性，会导致肾脏肿大，肾小管扩张以及上皮细胞坏死，不仅损害肝的代谢功能，还可能致畸、致肿瘤。质谱作为分析和鉴定未知化合物、量化已知化合物和解析化合物结构及分子性质，已成为分析化学学科中不可或缺的工具之一，同时多级质谱中某一个或几个特定的碎片离子也可以作为指纹图谱识别混合物中单一化合物，是一种准确、快速、可靠的分析方法[6 - 8]。目前，对橘霉素及其衍生物的电喷雾质谱研究鲜有报道。本文主要研究三种橘霉素类衍生物Penicitrinone A、Penicitrinone D和乙酸2,3,4,7,8,9-六甲基-10-氧-3,7,8,10-四氢-2H-1,6,12-三噁-苯并[fg]环戊二烯并[a]蒽-5-基酯(图1，分别标记为a、b、c)，利用电喷雾离子阱质谱(Electrospray Ionization Ion Trap Mass Spectrometry，ESI-IT-MS)研究碎片离子的结构，总结质谱裂解的规律，并通过密度泛函理论计算，验证裂解过程的解析，以期为此类化合物的结构鉴定和快速分析提供可靠的质谱资料和依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与条件

Bruker HCT电喷雾离子阱质谱仪(德国，布鲁克公司)，ESI电喷雾离子源，美国KD scientific注射泵，esquire Control质谱工作站等。采用正离子模式，扫描速度26 000m/z/s；样品通过蠕动泵以4 μL/min的速率送入离子源；喷雾电压3 500 V，干燥气N2温度300 ℃，流速8 L/min，雾化气N2压力6.89×104Pa；引入少量He(约5.0×10-4Pa)作为多级质谱的碰撞气，同时亦可以提高离子的诱捕效率；多级质谱碰撞能量为0.8 V。Bruker AVANCE II 400M核磁共振仪(瑞士，布鲁克公司)。

1.2 主要材料与试剂

海莲(Bruguierasexangulavar.rhynchopetala)采自海南东寨港自然保护区。从其叶中分离得到一株青霉菌(Penicilliumsp.)，经大米固体培养基发酵，代谢产物经乙酸乙酯萃取，浓缩得浸膏。以乙酸乙酯/石油醚，甲醇/氯仿梯度洗脱，硅胶填充色谱柱等分离得到化合物a、b和c[9]，利用1H NMR与13C NMR确认化学结构，经高效液相色谱检测其纯度均大于98%。分别取化合物a、b和c 0.01 mg静置于氘代溶剂CD3OD中24 h，经H/D交换得反应产物a(D)、b(D)和c(D)。

甲醇(色谱纯，美国Sigma-aldrich公司)。液氮、氦气(99.999%，海南金厚特种气体有限公司)。其余试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水，经0.45 μm滤膜过滤。

1.3 裂解能计算

采用B3LYP6-31G基组，对化合物分子及碎片离子的初始几何构型进行全自由度优化，并对收敛后的构型振动频率进行检测，确认无虚频后，获得稳定、精确的几何构型。化学键断裂能(BDE)由式(1)计算得到[10,11]：

BDE=E(R)+E(X)-E(RX)

(1)

其中，E(X)为丢失碎片的总能量，E(RX)为母离子碎片总能量，E(R)为丢失碎片后子离子总能量。

2 结果与讨论

2.1 橘霉素衍生物的碎裂机理及裂解能计算

化合物b和c结构中的-COOH和CH3COO-在一级裂解过程中，分别脱去CO2和CH2CO，得到与a相同的准分子离子峰(m/z381)，不利于区分进一步的裂解。故采用H/D交换的方法[12 - 15]，将O元素相连的活泼氢与氘原子交换，进而分析其裂解规律。氘代产物a(D)、b(D)和c(D)一级质谱扫描分别得m/z382、383和381的准分子离子峰(图2)，对比交换前a、b、c准分子离子峰m/z381，推测其活泼氢(酚羟基氢和羧羟基氢)分别被1、2、0个氘原子取代，这与对应的分子结构中活泼氢个数相吻合。化合物c(D)与a(D)的结构差异在于苯环相连的酯基，故其一级裂解与其相关。许多研究[16]表明，在ESI电离过程中，质子通常先加合在热力学稳定位点，这一位点有时并不直接诱导离子裂解，当质子从热力学稳定的初始位点转移到某一特定位点时，才能进一步发生电荷诱导的解离。由此推测，图2中化合物c(D)的碎片离子m/z381和m/z409(丰度16.21%)是O5位点质子化后，氢转移诱导的不同方式的裂解反应：一种是甲基氢迁移至O5位点后裂解脱除COCH2，另一种是质子化的O5位点在氢转移至羰基后脱去亚甲基，形成碎片离子的路径，如图3所示。

准分子离子进一步碰撞诱导裂解(CID，Collision-induced Dissociation)(图4)，出现了丢失19 u(或18 u)、33 u和41 u(或42 u)的碎片离子，且以丢失19 u(或18 u)的离子峰丰度最大，丢失33 u的离子峰次之，丢失41 u(或42 u)的离子峰丰度最小。结合a(D)、b(D)和c(D)的结构特点，推测19 u(或18 u)与41 u(或42 u)的裂解方式，与分子结构中氘取代的位点有关，而33 u的丢失，则可能是化合物分子结构中相同的部分。

当O5位点发生质子化，在正电荷诱导下a(D)、b(D)准分子离子脱去HDO(19 u)，c(D)脱去H2O(18 u)形成碎片离子。若质子化发生在O4位点(图5)，五元环则在正电荷诱导下裂解，脱去H2O和甲基，这一裂解过程与取代的氘原子无关，因此三个化合物都形成丢失33 u的奇电子碎片离子。

准分子离子CID-MS2丢失41 u(或42 u)的裂解途径，推测与分子结构中R1位H(或D)原子相关，当O2位点质子化，同环双烯结构在正电荷诱导下发生RDA(Retro Diels-Alder reaction)裂解，脱去CHCO(或者CDCO)形成奇电子阳离子(图6)。

键能用来描述化学键的稳定程度，其数值大小表示化学键断裂所需的能量，键能越大，键稳定性越高，断裂越困难。根据式(1)计算化合物a(D)CID-MS2不同裂解途径的键能，结果列于表1，发现裂解丢失HDO所需的键能最小，碎片离子[M+H-HDO]+总能量最低，稳定性最高，其次是碎片离子[M+H-H2O-CH3]+和[M+H-CHCO]+，CID-MS2质谱图中碎片离子峰丰度[M+H-HDO]+>[M+H-H2O-CH3]+>[M+H-CHCO]+，理论计算的结果也验证了裂解过程推测的可能性。

表1 a(D)CID-MS2裂解能的计算结果

2.2 化合物a(D)、b(D)和c(D)的几何构型和Mulliken电荷分析

运用密度泛函理论对化合物a(D)、b(D)和c(D)初始结构进行全自由度优化，获得稳定的几何结构，Mulliken电荷分布示于图7，编号1～7为不同的氧原子。从计算结果看，三个化合物都以O5原子电负性最强，O2、O4原子次之，也就是说，在ESI-MS正离子扫描模式下，O5位点最容易加氢离子化，其次是O2和O4位点。这与推导的裂解途径也相吻合。

3 结论

本工作采用H/D交换法，对橘霉素衍生物CID-MSn裂解过程及裂解机理进行研究，结合密度泛函理论，分析碎片离子的结构和相关物理化学特征。实验结果和Mulliken电荷分布都表明，O5、O2、O4是质子化的有利位点，诱导进一步裂解。CID-MS2观测到丢失H2O/HDO形成的离子碎片丰度最大，其次是丢失H2O和-CH3形成的离子碎片，丢失CHCO/CDCO形成的离子碎片丰度最小，计算结果也表明，各离子碎片的总能量依次增大，稳定性降低，键断裂能随碎片离子总能量的增大而增大。这为进一步研究橘霉素衍生物质谱裂解途径提供实验和理论依据，也为其他物质的质谱裂解研究提供参考。