毛细管电泳-电化学检测法测定淮山中薯蓣皂苷和腺苷含量

胡月芳，黄志强，李金芳

(贺州学院化学与生物工程学院,广西贺州 542899)

淮山别名山药、怀山药等，它含有活性多糖、薯蓣皂苷、腺苷、尿囊素、胆碱、黄酮、氨基酸等成分，是一种常用中药材和较佳的保健食品[1]。薯蓣皂苷具有抗肿瘤作用[2]，是合成治疗心血管疾病药物、甾体激素类等药物的重要原料[3]。腺苷是滋补品及药品的重要成分，具有调节中枢神经、抗凝血、镇静、安神等生理活性[4]。常见用来分析药物中薯蓣皂苷、腺苷分析方法有高效液相色谱(HPLC)法[5 - 7]、紫外分光光度法[8]。HPLC法具有分析速度快、分离效率高、试剂与样品消耗量少等优点，但色谱柱价格昂贵，容易被污染，分析成本高；紫外分光光度法灵敏度不高。

毛细管电泳(CE)已广泛应用于复杂物质分离检测中[9,10]，CE和电致化学发光联用技术已成功应用于一些活性物质的检测[11]，虽然灵敏度和选择性高，但重现性不够佳。毛细管电泳-电化学检测法(CE-ED)较适用于药用植物活性成分(黄酮、多糖、酚酸)[1，12]、氨基酸及复杂体系分离检测的研究[13 - 15]。如彭友元用该方法分离检测了蜂胶中的黄酮和酚酸(包括乔松素、槲皮素、高良姜素、对香豆酸、阿魏酸和咖啡酸6种物质)，检测限在1.0×10-8～1.0×10-7g/mL之间。并成功的应用于蜂胶样品中黄酮和酚酸的测定[12]。本文也用此方法成功检测了甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的浓度，其检出限均低于0.78 μmol/L，峰电流的相对标准偏差(RSD)低于2.03%，并用于淮山样品中甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的测定[1]。迄今为止，未见采用CE-ED法同时测定薯蓣皂苷、腺苷的报道。本文采用CE-ED法对淮山中薯蓣皂苷、腺苷含量进行测定，促进淮山资源的开发与利用，为淮山的质量研究和品质控制提供了依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

毛细管电泳-电化学检测(CE-ED)系统为自组装[15]，包括可调高压电源(±30 kV)，CHI660D电化学工作站(北京华科普天科技有限公司)；石英毛细管(55 cm×25 μm i.d.，河北永年光导纤维厂)；自行改装的三维定位调节器；三电极体系：工作电极为直径125 μm铜圆盘电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极；0.22 μm的乙酸纤维素滤膜(上海新亚净化器件厂)。

薯蓣皂苷、腺苷(上海化学试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

淮山样品购于阳光市场。

1.2 标准溶液及样品溶液的配制

1.2.1标准溶液薯蓣皂苷、腺苷标准储备液的质量浓度均为1.00 g/L，用二次蒸馏水配制，使用时用运行缓冲液稀释至所需浓度。

1.2.2样品溶液挑选新鲜淮山，于温度60 ℃烘干4 h后，用研钵研成细粉，准确称取5.0 g粉末，加入70%乙醇100 mL，在室温下浸泡24 h。离心过滤，滤渣用70%乙醇10 mL洗涤 2 次，最后用0.10 mol/L的Na2B4O7-H3BO3缓冲溶液定容至 250 mL。

1.3 实验方法

毛细管用0.1 mol/L的NaOH溶液、二次蒸馏水、缓冲溶液分别冲洗10、5、15 min后使用；铜圆盘电极用细砂纸打磨，用粒径0.3 μm的Al2O3粉末抛光平整，并于0～0.95 V(vs.Ag/AgCl)之间在NaOH溶液中扫描，进行电化学处理。采用自组装的CE-ED检测系统，调节工作电极与毛细管出口在同一直线上，最大程度靠近毛细管的末端，以优化后的条件电动进样，检测池为阴极电泳槽。所有溶液使用前均用0.22 μm乙酸纤维素滤膜过滤。

2 结果与讨论

2.1 电极及检测电位的选择

薯蓣皂苷和腺苷具有多个羟基，在碱性条件下，它们较易在铜圆盘电极上发生氧化反应，显示出较高的氧化电流、较高灵敏度和较高稳定性[16],且铜圆盘电极制作方便，材料价廉易得，故本实验选择其作为工作电极。实验考察了不同检测电位对0.1 mg/L的薯蓣皂苷、腺苷峰电流的影响，从图1可以看出:在不同检测电位都能获得氧化电流，且在0.55～0.95 V 之间随氧化电位的增加，薯蓣皂苷、腺苷的峰电流不断增高，且在0.8 V前增高较快，之后缓慢增高。实验也表明，随着检测电位的增大，本底电流和噪音均增加，当检测电位高于0.8 V 时基线很不稳定，基底电流明显提高，噪音也较大。综合考虑灵敏度及稳定性等因素，选择0.8 V为检测电位。

2.2 运行缓冲溶液浓度与pH的选择

分别考察了Na2HPO4-NaH2PO4及Na2B4O7-H3BO3体系对实验的影响。结果表明,Na2HPO4-NaH2PO4体系稳定性和灵敏度较低。且在碱性溶液中，Na2B4O7-H3BO3会与薯蓣皂苷和腺苷螯合形成配合阴离子而增加溶解度,减少了因吸附造成的峰拖尾等影响[17]。因此,本实验采用Na2B4O7-H3BO3体系作为运行缓冲液。

考察了不同浓度的Na2B4O7-H3BO3溶液对分离效果的影响。如图2所示，浓度较低时，薯蓣皂苷、腺苷因迁移时间较短未能得到好的基线分离；浓度太高时，分离时间随迁移时间变长而变长，且电泳电流增大导致基线噪音增大，峰电流降低。综合考虑，选择0.10 mol/L的Na2B4O7-H3BO3溶液为最优浓度。

固定Na2B4O7-H3BO3缓冲液浓度为0.10 mol/L，考察了pH在7.5～10.0范围内对分离检测效果的影响。结果表明，当pH值小于8.5时，薯蓣皂苷、腺苷不能基线分离，随着pH 的增加，迁移时间增长，分离效果提高，但电流峰形变宽。因此，考虑到要使薯蓣皂苷、腺苷全部分离，选择缓冲液较小pH较合适。综合考虑，选择pH=8.5的Na2B4O7-H3BO3溶液作为运行缓冲液。

2.3 分离电压和进样时间的选择

考察了分离电压在12～22 kV范围内对分离检测的影响。图3表明，当分离电压升高，迁移时间逐渐缩短，太高的分离电压使分离效果降低，但分离电压太低也会使迁移时间变长，电泳峰形变宽。综合考虑各物质的分离度、灵敏度、迁移时间及焦耳热等对分离检测的影响，选择16 kV为最优分离电压。

在选定最优运行缓冲溶液浓度、pH和分离电压条件下，考察了不同进样时间对薯蓣皂苷、腺苷峰电流的影响。如图4所示，开始时，峰电流随进样时间的增长而增高，但进样时间超过8.0 s后峰电流增加不明显，基线电流增高，电泳峰展宽，峰拖尾等现象，各分析物的分离效果降低，重现性差。综合考虑，选择8.0 s为最佳进样时间。

2.4 重现性、线性范围与检出限

配制一系列不同浓度的薯蓣皂苷、腺苷的混合标准溶液，以0.1 g/L 的薯蓣皂苷、腺苷混合标准溶液在最优条件下连续进样6次，在9 min 内实现基线分离，电泳图如图5(a)，薯蓣皂苷、腺苷的浓度分别在一定范围内与峰电流呈线性关系，线性范围、回归方程、相关系数及检出限如表1。薯蓣皂苷、腺苷峰电流的相对标准偏差(RSD)为1.7%、1.5%，迁移时间的RSD为0.7%、0.6%，重现性良好。

表1 薯蓣皂苷、腺苷混合溶液的回归方程、线性范围和检出限(n=6)

2.5 样品测定与回收率实验

取100 μL淮山样品提取液，加运行缓冲液稀释到1.00 mL，混匀后立即进样，检测淮山中薯蓣皂苷、腺苷的含量，在9 min 内实现基线分离，电泳图如图5(b)。与标准溶液的电泳图相比，1、2峰分别是薯蓣皂苷、腺苷的电流峰，分离效果良好。除此之外，还发现了一些未知峰，但对薯蓣皂苷、腺苷的分离测定不产生干扰，并不影响测定结果。

为了再次验证CE-ED方法的可靠性，在淮山提取液中添加适量薯蓣皂苷、腺苷标准溶液进行加标回收率实验，结果见表2。

表2 淮山中薯蓣皂苷、腺苷的含量及加标回收率(n=6)

3 结论

本文采用CE-ED 法检测淮山中薯蓣皂苷、腺苷的含量。实验表明，在优化条件下，薯蓣皂苷、腺苷在9 min内实现基线分离，被测物浓度与峰电流呈良好的线性关系。该方法简单可靠、准确、灵敏度高，重现性好，为淮山中薯蓣皂苷、腺苷的测定提供了一种有效的方法。淮山中薯蓣皂苷、腺苷含量的测定显示，淮山具有较高的营养价值，有良好的开发前景。