Ski在 大鼠脊髓损伤后不同时间的表达变化①

周开升，朱彦东，赵鑫，郭永强，寇江力，汪静，李森，龙在云，伍亚民，张海鸿

Ski在 大鼠脊髓损伤后不同时间的表达变化①

周开升1，2，朱彦东1，2，赵鑫1，2，郭永强1，2，寇江力1，2，汪静2，李森3，龙在云3，伍亚民3，张海鸿1

目的探究ski在大鼠正常及损伤后脊髓中的表达及随时间变化的规律。方法60只成年雌性Sprague-Daw ley大鼠，随机分为假手术组（n=30）和损伤组（n=30），各组设1周、2周、4周、8周、12周亚组，每个亚组6只大鼠。用Allen法制备T10打击损伤模型。损伤后1 d、3 d、1周、2周、4周、8周、12周行BBB后肢功能评分；术后1周、2周、4周、8周、12周，各组取3只大鼠行HE染色，观察损伤后脊髓病理变化及空洞形成；另3只大鼠行ski免疫荧光染色及半定量分析。结果损伤组各时间点BBB评分均低于假手术组（P＜0.05）。损伤后1周、2周，脊髓主要以坏死为主；4周时空洞完全形成，空洞周围有致密瘢痕组织；8周、12周空洞及瘢痕无明显变化，但损伤中心及附近脊髓明显变细。ski在正常脊髓中表达较低，损伤后ski表达逐渐增高，8周时达到高峰，12周时有所降低；ski在正常及损伤后12周脊髓中主要分布于白质；损伤后2周、4周和8周时灰质中出现明确ski表达。在损伤中心，ski在空洞周围密集表达。结论ski在脊髓损伤后表达。它可能作用于星形胶质细胞，并调控其活化、增生以及胶质瘢痕形成。

脊髓损伤；ski；星形胶质细胞；瘢痕；大鼠

［本文著录格式］周开升，朱彦东，赵鑫，等.Ski在大鼠脊髓损伤后不同时间的表达变化［J］.中国康复理论与实践，2016，22（9）:1015-1019.

CITED AS:Zhou KS，Zhu YD，Zhao X，etal.Expression and change of skiafter spinal cord injury in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（9）:1015-1019.

脊髓损伤后神经功能的恢复一直是医学研究中的热点及难点，迄今尚未取得突破性进展。原癌基因ski及其编码的蛋白作为一种细胞类型特异性的多功能分子，在肿瘤发生、创伤愈合、肝脏再生等多个领域发挥着重要作用［1］。相关研究证实，ski在胚胎神经发育和部分中枢及周围神经系统病理生理过程中也扮演着重要角色［2-5］；转化生长因子-β、骨形态发生蛋白、Wnt/β-catenin等多种信号通路是其发挥调控作用的主要途径［2，6-7］；脊髓损伤后一系列病理生理变化也与这些信号通路密切相关。我们推测，ski可能在脊髓损伤过程中发挥重要调控作用。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组

60只成年雌性Sprague-Daw ley大鼠，体质量200 g左右，由第三军医大学大坪医院动物中心提供。实验前1周，饲养动物于实验室，自然昼夜采光，自由饮食、水，保持室温25～28℃。动物饲养及实验过程均遵守实验动物管理及保护的有关规定。动物编号，随机数字法分为假手术组和损伤组，每组30只。每组再分为1周、2周、4周、8周、12周五个亚组。

1.2主要仪器和试剂

RM 2007 A llen打击器：美国新泽西州大学。CM 1900冰冻切片机、SP-2激光共聚焦显微镜：LEICA公司。无毒环保苏木素-伊红（HE）染液：南京建成科技有限公司。ski（H-329，sc-9140）：SANTA CRUZ。Alexa Fluor®488标记山羊抗兔IgG（H+L，ZF-0511）：北京中杉金桥。Image J1.50i图像分析软件：National Institutesof Health。

1.3模型建立

大鼠术前禁食12 h。1%戊巴比妥钠4m l/kg腹腔注射麻醉，角膜反射消失表明麻醉成功。俯卧位固定于手术台上，剃去背部皮毛，碘伏及酒精术区皮肤消毒。定位T10，以T10为中心背部正中切口，长约2 cm，钝性分离棘突及椎旁肌肉，咬开T9-11椎板，显露脊髓（未损伤硬脊膜）。用A llen打击器打击T10脊髓，打击强度10 g×25mm，打击后立即移开打击棒。打击成功标志：打击后大鼠后肢发生不同程度抽搐之后瘫软，尾巴发生痉挛性摆动。

假手术组仅咬开椎板，不打击。

逐层缝合肌肉和皮肤，放回笼中，置25～28℃动物房内。术后予青霉素16万U肌肉注射，连续3 d；每天挤压膀胱协助排尿3次，直至恢复自主排尿。

1.4检测方法

1.4.1行为学评分

分别于造模后1 d、3 d、1周、2周、4周、8周、12周时，采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分法评估大鼠后肢行为学功能。1 d、3 d评分时，偏离平均值2分以上者视为造模失败，予以剔除，重新造模补充。评分由2名熟悉BBB评分方法的非本组实验人员进行，将大鼠逐一放入旷场内，观察其活动4min，评估其后肢功能。

1.4.2HE染色

造模后1周、2周、4周、8周、12周时，每亚组各取3只动物，0.01mol/L PBS左心室快速灌注，至右心耳流出清亮液体后，改用4%多聚甲醛灌注固定。取出脊髓组织，4%多聚甲醛固定24 h。30%蔗糖PBS溶液充分脱水至沉糖，以损伤为中心、上下各3～4mm，截取长约6～8mm脊髓组织，OCT冰冻切片包埋剂包埋，纵行连续切片，HE染色，光镜下观察。

1.4.3免疫荧光染色

各亚组另3只大鼠，取脊髓，经上述方法处理后，连续冰冻横切片，行免疫荧光单标ski染色。0.01 mol/L PBS冲洗5 min，共3次；0.3%Triton X-100破膜25min，0.01mol/L PBS冲洗5min，共3次；10%正常山羊封闭血清封闭30 min，甩干后不洗，滴加ski一抗（1∶50），4℃冰箱过夜；自然复温至室温，0.01 mol/L PBS冲洗5 min，共3次（避光操作），滴加山羊抗兔A lex fluor488（1∶200），37℃烤箱孵育1 h，0.01mol/L PBS冲洗5min，共3次；DAPI染核2min，0.01mol/L PBS冲洗5min，共3次；晾干后甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察。

尽量选取离损伤中心同样距离的组织切片，激光共聚焦显微镜下扫描拍照时全程以同样参数扫描，扫描过程中除可调整焦距以外，其他参数均保持不变，选取同一部位、同一视野荧光照片，Image J 1.50i软件分析，计算平均光密度值。

1.5统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。BBB评分、平均光密度值均用（xˉ±s）表示，采用独立样本t检验。显著性水平α=0.05。

2　结果

2.1一般情况

损伤组大鼠术后苏醒，精神状态较差，双侧后肢运动功能完全丧失，并开始出现尿潴留；术后1周内，部分大鼠出现血尿和腹部胀气，之后逐渐恢复，10 d左右基本恢复自主排尿。假手术组大鼠术后苏醒即可有部分运动，基本无后肢功能障碍，无尿潴留及血尿，无明显腹部胀气，但术后3 d内部分大鼠有脊柱不稳，3 d后运动功能基本恢复正常。

2.2BBB评分

损伤组大鼠3 d内评分均为0～1分；术后1周内后肢功能恢复较慢，1～4周功能恢复较为迅速，4～12周功能恢复速度再次放缓。假手术组术后1～3 d部分大鼠可有尾巴下垂或损伤部位脊柱不稳现象，3 d后基本恢复。损伤组各时间点评分均低于假手术组（P＜0.05）。见图1。

图1　术后两组各时间点BBB评分比较

2.3HE染色

假手术组脊髓整体结构完整，无损伤及坏死，细胞排列有序，胞核形态清晰。

损伤组打击1周后，损伤中心逐渐出现组织坏死，开始出现较小坏死空洞，损伤周围胞核密集；2周时，坏死区域继续扩大，损伤中心组织坏死严重，空洞逐步增大；4周时，坏死组织逐渐减少，空洞完全形成，空洞周围细胞增生、胞核排列密集，围绕空洞形成致密瘢痕组织；8周时，损伤部位脊髓开始萎缩变细，空洞基本稳定，局部可见纤维组织长入空洞，形成致密条索，空洞周围有明显的瘢痕形成；12周时，损伤部位及附近脊髓明显变细，空洞无明显变化，空洞周围瘢痕稳定。见图2。

图2　假手术组及损伤各亚组脊髓纵切（HE染色，bar=500μm）

2.4免疫荧光染色

损伤中心上端、位置相对统一、组织结构相对完整的切片中，ski在假手术组及损伤各亚组均有表达。假手术组中，ski表达较弱，分布均匀，主要位于白质，灰质中无明显表达。损伤组1周和2周时，ski表达较假手术组有所增强，且灰质中出现明显表达；4周和8周时，灰质及白质中ski表达明显增加；12周时，ski表达较4周、8周时有所下降，灰质中表达信号再次减少。

与假手术组比较，打击后1周，ski表达无显著性差异（P＞0.05）；2～12周时ski表达显著增高（P＜0.001），表达量在8周时达到高峰。见图3、图4。

图3　假手术组及损伤各亚组ski表达平均光密度值

图4　假手术组及损伤各亚组脊髓上端ski表达（免疫荧光染色，200×）

选择ski表达与假手术组有显著性差异的2周、4周、8周、12周四个损伤亚组损伤中心组织切片，不同时间点，ski均在损伤空洞周围密集表达；其中，4周、8周、12周时，ski在空洞周围形成一圈致密的高表达带；空洞周围阳性细胞与空洞远端阳性细胞相比，细胞体积明显增大。见图5。

图5　损伤部分亚组脊髓损伤中心ski表达（免疫荧光染色，200×）

3　讨论

脊髓损伤后神经功能的康复依然是医学所面临的重大挑战。脊髓损伤后一系列病理变化的深入研究及新的分子机制的发现依然被视为解开这一难题的关键。

ski作为一种进化保守蛋白，在不同物种中广泛参与调节多种细胞的增殖及分化过程［2］。在神经系统中，ski不但可以调控神经系统胚胎发育［3］，而且在施万细胞增殖、胶质母细胞瘤等一些神经系统病理变化中发挥重要作用［4-5］。

本研究显示，ski在正常脊髓组织中处于持续低表达状态；脊髓损伤后ski表达逐渐增高，8周时达到顶峰，12周时稍有降低。病理观察发现，从第4周开始，空洞周围有明显致密瘢痕组织形成；8～12周时，瘢痕组织基本处于稳定状态，无明显变化；与既往研究基本相符［8］。ski表达与脊髓损伤后胶质瘢痕形成有一定相关性。

在损伤中心，ski在空洞周围形成密集的高表达带，4周、8周及12周时，这种现象尤为明显。ski的分布与胶质瘢痕形成高度吻合。我们推测，ski可能与胶质瘢痕的形成有关。

有研究表明，脊髓损伤可刺激神经前体细胞（如室管膜区细胞等）分化为活化的星形胶质细胞，从而形成胶质瘢痕［9］。本研究显示，ski在正常脊髓中主要表达于白质，灰质中基本不表达；损伤后，灰质中开始出现ski，12周时ski在灰质中的表达再次减少。相关研究证实，室管膜区及室管膜下区的神经祖细胞在脊髓损伤后1周时可分化为星形胶质细胞，并从位于灰质的中央管周围向损伤周围迁移聚集，最终形成胶质瘢痕；在瘢痕形成稳定后逐步消失［8］。这与我们发现的ski在不同时期灰质与白质中的表达变化规律基本吻合，但是两者的明确关系有待进一步研究。

活化的星型胶质细胞肥大、增生，并向损伤部位迁移聚集，是胶质瘢痕形成的重要过程［10］。近年来，关于胶质瘢痕是否有利于神经损伤的修复一直存在争议。有学者认为，胶质瘢痕既是一种质密的物理屏障，也分泌一些细胞因子，共同抑制神经修复过程中的轴突再生和突触形成［11-13］；也有研究者提出，胶质瘢痕可以抑制神经炎症反应的扩散，保护神经组织免受创伤后的次级损伤［10，14］。星形胶质细胞活化、增生与胶质瘢痕形成机制的研究是至关重要的课题。

从ski表达阳性细胞的形态及变化分布规律来看，ski极有可能表达于星形胶质细胞，且在活化后的星形胶质细胞中表达明显增多。结合ski表达与脊髓损伤后病理变化的相关性，以及ski在空洞周围形成致密的高表达带的现象，我们推测，ski可能作为一种新的信号分子，调控星形胶质细胞的活化、增生等过程，并且可能以此调控胶质瘢痕的形成。这一假设需要ski表达的细胞定位证据及后续的研究进一步证明。

综上所述，本研究首次明确ski在脊髓损伤后的表达变化及分布规律，结合已被证实的胶质瘢痕形成规律，我们推测，ski可能是一种作用于星形胶质细胞并调控其活化、增生以及胶质瘢痕形成的信号分子。

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Expression and Changeof Skiafter SpinalCord Injury in Rats

ZHOU Kai-sheng1，2，ZHU Yan-dong1，2，ZHAO Xin1，2，GUO Yong-qiang1，2，KOU Jiang-li1，2，WANG Jing1，2，LISen3，LONG Zai-yun3，WU Ya-min3，ZHANG Hai-hong1
1.Department of Orthopedics，Second Clinical Medical College of Lanzhou University，Lanzhou，Gansu 730030，China；2.Key Laboratory of Orthopedics of Gansu Province，Lanzhou，Gansu 730030，China；3.State Key Laboratory of Trauma，Burns and Combined Injury，the Third Departmentof Research Institute of Surgery，Daping Hospital，Third Military MedicalUniversity，Chongqing 400042，China

ZHANG Hai-Hong.E-mail:zhanghaihong1968@sina.com

Objective To explore the expression and the changes of skiwith time in the injured spinal cord in rats.Methods Sixty adult female Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into sham group（n=30）and injury group（n=30），each group were further divided into 1 week，2weeks，4weeks，8weeksand 12weekssubgroups，with 6 rats in each subgroup.Spinal cord injury at T10wasestablished withmodified A llen's technique（10 g×25mm）in the injury group.The hindlimbs behavior of rats was rated with Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）scores 1 day，3 days，1 week，2 weeks，4 weeks，8 weeks and 12 weeks after spinal cord injury.Three rats in each subgroup were stained with HE staining to observe the pathological changesof the spinal cord and the formation of cavity.The other 3 ratswere analyzed with immunofluorescence staining of skiand semiquantitative analysis.Results The BBB scores of each time pointwere less in the injury group than in the sham group（P＜0.05）.Necrosiswas themajor pathological change in the injury groups 1 and 2 weeks after injury；cystic cavity completely formed 4 weeks after injury，with dense scar tissue around it；there was no significant change in the cavity and scar 8 and 12 weeks after injury，however，the adjacent spinal cord was obviously thinner.Ski expressed little in the normal spinal cord，and expressed more andmore after injury，peaked at8weeksand decreased then.Skiwasmainly observed inwhitematter in the sham group and 12weeks injury subgroup，which was in gray matter 2，4 and 8 weeks after injury.Skiwas highly expressed around the cavity in injury center and formed high expression band.Conclusion Skiexpressesafter spinal cord injury in rats，thatmay be associated with the activation and proliferation of astrocytesand the formation of glialscar.

spinal cord injury；ski；astrocyte；scar；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.09.006

R651.2

A

1006-9771（2016）09-1015-05

2016-06-02

2016-06-13）

国家自然科学基金项目（No.30772299）。

1.兰州大学第二医院骨科，甘肃兰州市730030；2.甘肃省骨关节疾病研究重点实验室，甘肃兰州市730030；3.第三军医大学大坪医院野战外科研究所三室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆市400042。作者简介：周开升（1990-），男，汉族，甘肃武威市人，硕士研究生，主要研究方向：脊柱脊髓损伤。通讯作者：张海鸿，主任医师，副教授，硕士研究生导师，主要研究方向：脊柱外科。E-mail:zhanghaihong1968@sina.com。