电针对慢性应激抑郁模型大鼠海马磷酸二酯酶4及其亚型表达的影响①

景泉凯，赛音朝克图，姚海江，吕威，奥村悠斗，杨利娟，刘俊彤，李志刚

·基础研究·

电针对慢性应激抑郁模型大鼠海马磷酸二酯酶4及其亚型表达的影响①

景泉凯1，赛音朝克图2，姚海江3，4，吕威1，奥村悠斗1，杨利娟1，刘俊彤1，李志刚1

目的探讨电针治疗抑郁症的生物学机制。方法成年雄性Sprague-Daw ley大鼠32只随机分为空白组（n=8）、模型组（n=8）、电针组（n=8）、氟西汀组（n=8），采用慢性不可预知性应激刺激结合孤养的方式建立抑郁模型。开野试验观察大鼠行为学变化。RT-PCR法检测大鼠海马磷酸二酯酶4（PDE4）A、PDE4D表达。结果模型组大鼠开野试验水平运动次数和垂直运动次数较空白组显著降低（P＜0.001），电针组和氟西汀组较模型组显著增加（P＜0.001）。PDE4A、PDE4DmRNA表达，电针组比模型组显著减少（P＜0.001）。结论抑制PDE4A、PDE4D表达可能是电针抗抑郁作用的机制之一。

抑郁；电针；慢性应激；磷酸二酯酶4；大鼠

［本文著录格式］景泉凯，赛音朝克图，姚海江，等.电针对慢性应激抑郁模型大鼠海马磷酸二酯酶4及其亚型表达的影响［J］.中国康复理论与实践，2016，22（9）:1011-1014.

CITED AS:Jing QK，Saiyin CKT，Yao HJ，et al.Effect of electroacupuncture on expression of phosphodiesterase 4 and subtypes in hippocampus in ratswith chronic stressdepression［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（9）:1011-1014.

抑郁症是一种以持续心境低落为主要特征的综合征。作为一种严重危害人类健康的情感障碍性精神疾病，抑郁症具有高发病率、高致残率和高自杀率的特点。世界卫生组织（WHO）预测，到2020年抑郁症将成为全球仅次于心脏病的第二大疾患［1-2］。抑郁症是一个涉及多机制的复杂病症，其发病机制尚未完全阐明［3-5］。磷酸二酯酶4（phosphodiesterase 4，PDE4）近年来一直被认为是一个潜在的抗抑郁靶点而被大量研究［6-7］。PDE4抑制剂在抑郁模型动物的行为学实验中表现出很好的抗抑郁效果［8-9］。

针刺疗法对抑郁症有较好的临床疗效，与抗抑郁药相比，针刺具有起效快、毒副作用小、费用低廉等优势。临床和实验研究表明，针刺是通过多层次、多靶点、多通路综合调节抑郁症症状［10-11］。本研究探讨电针抗抑郁作用与PDE4的关系，以期能为临床电针抗抑郁作用提供进一步的理论依据。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组

成年Sprague-Daw ley大鼠40只，雄性，体质量（200±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。温度（25±2）℃，湿度（50±20）%，饲养于北京中医药大学清洁级动物房。实验前适应性饲养1周，自由饮水、进食，自然昼夜节律光照。1周后采用开野试验、糖水试验及体质量测量进行行为学评分，剔除开野试验过于活跃和安静的大鼠，余下32只大鼠，采用随机数字表法分为空白组、模型组、电针组、氟西汀组，每组8只。

1.2药品与试剂

TRNzol试剂：天根生化科技（北京）有限公司。DNAMarker：TAKARA公司。盐酸氟西汀胶囊：礼来苏州制药有限公司。

1.3实验仪器

QL-902涡旋振荡仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。Centrifuge 5415D离心机：EPPENDORF公司。NANODROP 2000分光光度计：THERMO SCIENTIFIC公司。ABI7500荧光定量PCR仪：APPLIED BIOSYSTEMS公司。

LH202韩氏穴位神经刺激仪：北京大学神经科学研究所监制，北京华卫产业有限公司。华佗牌无菌针灸针，直径0.3mm，长13mm：天津杏林书院医疗器械有限公司。

1.4造模方法

除空白组外，其余大鼠采用慢性轻度不可预见性应激（chronic unpredictablemild stress，CUMS）结合孤养的方法［12-13］造模。刺激方式包括以下7种：①4℃冷水中游泳5min；②禁食24 h；③禁水24 h；④昼夜颠倒24 h；⑤夹尾（距离尾尖2 cm，3min）；⑥潮湿环境24 h；⑦束缚3 h。随机刺激21 d，保证每种刺激平均应用3次。

除空白组群养外，其余均单只饲养，分别饲养于不同房间。

1.5干预方法

空白组正常条件饲养21 d，不予任何刺激。模型组每天施以与电针组相同时间、同等强度的捆绑，并进行慢性应激造模处理21 d。电针组行慢性应激造模处理21 d，并于每天应激造模前1 h行电针治疗：参照《实验针灸学》［14］，取百会、印堂，平刺，百会穴针尖向后头部，印堂穴针尖向鼻尖方向，进针0.5～1 cm；电针频率2 Hz，电流强度以大鼠头部微颤为宜，每次留针20min，每天1次。氟西汀组接受进行慢性应激造模处理21 d，每天造模前1 h将氟西汀用生理盐水配成1mg/m l溶液，2mg/kg灌胃给药，每天1次。

1.6开野试验

［15］方法，在自制敞箱（80×80×40 cm）中进行。内侧周壁及底部均为黑色，底部用白线划分为面积相等的25块方格。将大鼠置于中心方格内，人距离大鼠1m以上，观察大鼠5min内穿越格数，记为水平运动次数；后肢直立次数记为垂直运动次数。每只动物检测完毕，清理干净敞箱后再进行下一只动物的检测。分别于造模前和实验第22天进行。

1.7取材

造模后22 d，大鼠10%水合氯醛380mg/kg腹腔注射麻醉，迅速断头，按照大鼠神经解剖图谱在超净台内冰上剥离大脑，取海马50mg放入1.5m l灭菌离心管中，-80℃保存。

1.8RT-PCR

根据文献确定GAPDH、PDE4A及PDE4DmRNA的PCR引物序列，引物由北京INVITROGEN公司合成。

GAPDH：上游5'-CCT TCC GTG TTC CTA CCC C-3'；下游5'-GCCCAGGATGCCCTTTAG TG-3'

PDE4A：上游5'-CAG TGG ACC GAC CGC ATC A-3'；下游5'-TCCAGCGTG TCCAGGATG TC-3'

PDE4D：上游5'-CCG CTT TGG AGG CTG TTT TC-3'；下游5'-TAC ATC AAG GCA AGT TCC GAG TTT-3'

TRNzol总RNA提取试剂提取mRNA。紫外分光光度计定量mRNA纯度较好。逆转录反应采用两步法，采用PrimeScriptTMRT reagentKitwith gDNA Eraser进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，反应体系20μl。热循环参数：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火、延伸40 s，共45个循环。PCR相对定量分析以在组织中表达稳定的GAPDH条带为内参照，用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

1.9统计学分析

数据以（xˉ±s）表示。用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。多组间均数比较用单因素方差分析，两组间比较用LSD检验。显著性水平α=0.05。

2　结果

2.1开野试验

应激前各组大鼠水平运动和垂直运动无显著性差异（P＞0.05）。应激刺激后，与空白组比较，模型组水平运动及垂直运动均显著减少（P＜0.001）。与模型组比较，氟西汀组与电针组水平运动和垂直运动均显著升高（P＜0.001）。见表1。

表1　各组应激前后开野试验比较

2.2RT-PCR

与空白组比较，模型组海马PDE4A、PDE4D mRNA表达显著增多（P＜0.001），电针组PDE4A、PDE4D mRNA表达较模型组显著减少（P＜0.001），与空白组比较无显著性差异（P＞0.05）。氟西汀组海马PDE4A、PDE4D mRNA表达与空白组无显著性差异（P＞0.05）。见表2。

3　讨论

抑郁症是一种涉及多种神经递质、脑区及环路的疾病，脑内其他诸多生化物质或/和系统也参与抑郁症的病理学过程。目前针刺治疗抑郁症的机制研究多从神经递质及其受体、神经内分泌系统、神经营养因子及相关信号通路、细胞因子、神经胶质细胞及神经元凋亡等方面入手［16］。

表2　各组海马PDE4A、PDE4Dm RNA表达（2-△△CT）

近年来，PDE4抑制剂对于抑郁症的研究已经较为深入和成熟［17］。

PDE4是环磷酸腺苷（cAMP）特异性水解酶。cAMP是细胞内重要的第二信使，参与机体多种新陈代谢活动，腺苷酸环化酶的合成和PDE的水解作用之间的平衡决定其胞内的浓度水平。哺乳动物PDE是一个蛋白酶超家族，分为11个亚型［18］，其中PDE4能够特异性水解胞内cAMP，对控制胞内cAMP水平有重要作用，被认为是治疗抑郁症、认知损伤等神经精神疾病的重要潜在靶标［19-20］。在哺乳动物中，PDE4有A、B、C、D 4个亚型，其中PDE4A和PDE4D是抗抑郁药发挥治疗活性作用的主要亚型［21］。

本研究采用的CUMS模型，与抑郁症具有高度相似性，可引起一系列与抑郁症患者相似的行为和神经系统改变，是目前公认的经典模型之一［22］。本研究显示，模型大鼠的探究行为和运动能力降低，提示模型复制成功；电针治疗后，大鼠抑郁行为改善。

海马是边缘系统重要组成部分，参与情绪、学习和记忆、行为、免疫等的调节，它的损伤在各种应激所致疾患中起关键作用［23-24］。抑郁症病位在脑，针灸治疗重在健脑调神。电针督脉经穴为主的头部穴位在抑郁症治疗中较为常用［25］。本研究选用临床使用频率最高的百会和印堂。百会又名“巅上”、“五会”，是手足三阳与督脉、肝经之会，针刺百会穴可以平肝潜阳，疏肝理气。针刺印堂有活络疏风，镇痉安神的作用。

本研究显示，模型大鼠海马PDE4A、PDE4D表达量增加，电针组较模型组减少，且与空白组无显著性差异。提示抑郁症与海马内PDE4A、PDE4D表达升高有关；抑制PDE4A、PDE4D表达可能是电针抗抑郁作用的机制之一。

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Effect of Electroacupuncture on Expression of Phosphodiesterase 4 and Subtypes in Hippocam pus in Ratswith Chronic StressDepression

JING Quan-kai1，SAIYIN Chao-ke-tu2，YAO Hai-jiang3，4，LÜWei1，AOCUN You-dou1，YANG Li-juan1，LIU Jun-tong1，LIZhi-gang1
1.Departmentof Acupuncture and Massage，Beijing University of ChineseMedicine，Beijing 100029，China；2.InnerMongolia InternationalMongolian Hospital Traditional Therapy Technique，Hohhot，InnerMongolia 010065，China；3.TreatmentCenterof TraditionalChineseMedicine，Beijing Bo'aiHospital，China Rehabilitation Research Center，Beijing 100068，China；4.CapitalMedicalUniversity Schoolof Rehabilitation Medicine，Beijing 100068，China

LIZhi-gang，SAIYIN Chao-ke-tu.E-mail:lizhigang620@126.com（LIZhi-gang）；saiyin2012@ 126.com（SAIYINChao-ke-tu）

Objective To explore the biologicalmechanisms of electroacupuncture（EA）for depression.Methods Forty male adult Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into control group（n=8），model group（n=8），EA group（n=8）and fluoxetine group（n=8）.Depressivemodelswere established with lonely raising and chronic unpredictablemild stress.They were tested with Open-field Test，and the expression of phosphodiesterase 4（PDE4）A and PDE4D in hippocampuswas detected with RT-PCR.Results The cross and rear scores were significantly lower in themodelgroup than in the controlgroup（P＜0.001），while it increased in the EA group and the fluoxetine group（P＜0.001）.Compared with themodelgroup，the expression of PDE4A and PDE4D decreased in the EA group（P＜0.001）.Conclusion Electroacupuncturemay relieve depression through inhibiting the expression of PDE4A and PDE4D.

depression；electroacupuncture；chronic stress；phosphodiesterase 4；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.09.005

R749.4

A

1006-9771（2016）09-1011-04

2016-04-10

2016-05-17）

1.国家自然科学基金地区科学基金项目（No.81360576）；2.国家自然科学基金项目（No.8172860）；3.内蒙古自治区自然科学基金项目（No.2015MS08130）。

1.北京中医药大学针灸推拿学院，北京市100029；2.内蒙古自治区国际蒙医医院，内蒙古呼和浩特市010065；3.中国康复研究中心北京博爱医院康复科，北京市100068；4.首都医科大学康复医学院，北京市100068。作者简介：景泉凯（1990-），男，汉族，吉林长春市人，硕士研究生，主要研究方向：针刺干预中枢神经损伤的机理研究。通讯作者：李志刚、赛音朝克图。E-mail:lizhigang620@126.com（李志刚）；saiyin2012@126.com（赛音朝克图）。