响应面法优化酒糟水解液发酵生产木糖醇

2016-10-14王浩李炎璋李迎赵亮宋健贾士芳

中国酿造 2016年6期

关键词：装液木糖醇假丝

王浩，李炎璋，李迎，赵亮，宋健，贾士芳

（太原科技大学化学与生物工程学院，山西太原030000）

响应面法优化酒糟水解液发酵生产木糖醇

王浩，李炎璋，李迎，赵亮，宋健，贾士芳*

（太原科技大学化学与生物工程学院，山西太原030000）

研究热带假丝酵母（Candida tropicalis）GIM2.7发酵酒糟水解液生产木糖醇的最佳工艺条件，提高酒糟资源的利用率。在单因素试验结果的基础上，选择主要因素接种量、装液量、有机氮源添加量进行响应面优化。结果表明，当接种量为16%、有机氮源添加量5%、装液量109 mL/250 mL时，木糖醇转化率可达到57.8%，与预测值（60.4%）相接近，说明响应面优化酒糟水解液生产木糖醇的发酵条件是有效的。

酒糟水解液；木糖醇；发酵；热带假丝酵母；响应面法

木糖醇是一种重要的功能性五碳糖醇，其甜度与蔗糖相当，热量与葡萄糖相当，在体内代谢不需胰岛素参与，也不会造成血糖的急剧变化，可作为糖尿病人的甜味替代品［1］。此外，由于木糖醇具有预防龋齿、溶解热大、不发生美拉德反应等功效以及具备甘油和其他多元醇的优异特性，可广泛用于医疗、化工、食品等行业［2-3］。

目前，国内外工业化生产木糖醇的主要方法是化学合成法，即用富含半纤维素的玉米芯、棉子壳、甘蔗渣、桦木片等农副产品经酸（如HCl、H2SO4）水解成木糖后，经纯化处理和加氢反应制得木糖醇，该方法成本高、产率低、污染较严重［4］。鉴于化学法生产木糖醇存在的一些弊端，有学者开始关注利用微生物发酵法来生产木糖醇［5］。有文献报道，酵母转化木糖醇的能力最强，产木糖醇的酵母菌主要集中在假丝酵母属（Candida），如热带假丝酵母（Candida tropicalis）在24 h内可转化90%以上的木糖产木糖醇［6-7］。

白酒糟成分比较复杂，但以半纤维素物质为主。我国的白酒糟年产量已经达到2 100万t以上［8］，产量如此庞大的酒糟如果不加合理利用，既会污染环境也会造成资源的浪费。利用酒糟为原料发酵产木糖醇在国外已有相关报道，而在国内则研究甚少［9］。酒糟的成本较低，利用酒糟为原材料发酵生产木糖醇可大大降低木糖醇生产的成本，本研究采用响应面法探究热带假丝酵母（C.tropicalis）GIM2.7发酵酒糟水解液生产木糖醇的最佳工艺条件，以期降低生产成本，提高木糖醇的转化率。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1原材料和菌种

酒糟：太原某酒厂。

热带假丝酵母（Candida tropicalis）GIM2.7：广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.2培养基

斜面培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO42 g/L，pH自然，115℃灭菌15 min。

液体种子培养基：木糖10 g/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO42 g/L，pH自然，115℃灭菌15 min。

发酵培养基：每100 mL酒糟水解液（含木糖约36 g/L）补加5 mL有机氮源溶液（其中酵母膏和蛋白胨质量浓度均为50 g/L），起始pH 5.0，115℃灭菌15 min。

1.2仪器与设备

UV-5200紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；HZQ-X100立式摇床：常州杰博森仪器有限公司；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器厂；PHS-25C数显酸度计：上海宇隆仪器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HH-4数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1酒糟水解液的制备

称取一定量烘干后的白酒糟，粉碎至60目，按1∶10（g∶mL）的料比加入2%的混合酸（浓磷酸和浓盐酸各1%），浸泡过夜，121℃水解2.5 h，过滤除去酒糟残渣，于70℃真空适当浓缩后，以2.5%的比例加入活性炭脱毒60min。使用活性炭脱毒可以有效除去水解液中的糠醛和酚类化合物等发酵抑制物，提高发酵性能［10］。得到的水解液用过量的石灰乳中和（pH 10.0），再用浓磷酸回调至pH 5.0，抽滤，于4℃冷藏备用。

1.3.2种子液制备

将冻干热带假丝酵母（Candida tropicalis）GIM2.7转接至斜面培养基，30℃活化36 h，然后挑取斜面菌种3环，接种至装液量为100 mL/250 mL的液体种子培养基中，于30℃，180 r/min的摇床上培养24 h。

1.3.3酒糟水解液发酵生产木糖醇

取10 mL种子液接种至装液量为100 mL/250 mL的发酵培养基中，于30℃摇床发酵48 h［11-12］（其中0～24 h转速为180 r/min，24～48 h转速为120 r/min），发酵过程不做任何处理。发酵结束后，取适量发酵液于3 000 r/min离心10 min，收集上清液，待分析木糖醇、木糖含量。

1.3.4木糖醇转化率的测定方法

木糖含量测定采用地衣酚法［13］，并绘制木糖标准曲线方程：y=0.049 1x+0.035 6（R2=0.993 1）。根据木糖标准曲线方程，计算发酵液中木糖含量。

木糖醇含量测定采用变色酸法［14］，并绘制木糖醇标准曲线方程：y=0.088 8x+0.015 2（R2=0.993 1）。根据木糖醇标准曲线方程，计算发酵液中木糖醇含量。

木糖醇转化率的计算公式如下：

1.3.5单因素试验设计

以木糖醇转化率为评价指标，研究酒糟水解液接种量（5%、10%、15%、20%、25%）、装液量（60mL/250mL、80mL/250mL、100mL/250mL、120mL/250mL、140mL/250mL）、氮源添加量（0、3%、5%、7%、9%）、初始pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）对发酵效果的影响。

1.3.6响应面最优试验设计

根据单因素试验结果，分别以接种量、装液量、氮源添加量为主要影响因素，以木糖醇转化率为响应值，采用Box-Behnken中心组合试验设计原则进行3因素3水平试验设计和使用Design Expert 7.0软件对数据进行分析。响应面试验因素与水平见表1。

表1　响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1接种量对木糖醇转化率的影响

接种量对木糖醇转化率的影响，结果见图1。

图1　接种量对木糖醇转化率的影响Fig.1 Effect of inoculum on the conversion rate of xylitol

由图1可知，在5%～25%范围内，随着接种量的增加，木糖醇转化率先增后减，当接种量为15%时，木糖醇转化率达到最大值，为42.9%。这可能是由于酒糟水解液环境复杂，接种量过小（5%～10%），菌体受发酵液中糠醛、乙酸、酚类化合物等发酵抑制物的影响［15］，延长了发酵时间，使木糖醇积累少，转化率低；但接种量过大（＞15%），大量的木糖和其他营养成分用于菌体生长，发酵产木糖醇少，表现在木糖醇转化率明显降低。因此，本试验选择接种量为15%。

2.1.2装液量对木糖醇转化率的影响

装液量对木糖醇转化率的影响，结果见图2。

由图2可知，当装液量为60～100 mL/250 mL时，随着装液量的增加，木糖醇转化率升高，这是因为发酵液中溶氧充足，一方面菌体快速繁殖，木糖主要用于菌体生长，木糖醇代谢相对较慢，另一方面将导致形成的木糖醇再度氧化成木酮糖［16］；当装液量为100 mL/250 mL时，木糖醇转化率达到最高值，为46.1%；当装液量＞100 mL/250 mL时，发酵液中溶氧量下降，导致菌体生长不足，菌体浓度较低，从而影响了木糖醇的积累。因此，本试验选择装液量为100 mL/250 mL。

图2　装液量对木糖醇转化率的影响Fig.2 Effect of liquid volume on the conversion rate of xylitol

2.1.3有机氮源添加量对木糖醇转化率的影响

有机氮源添加量对木糖醇转化率的影响，结果见图3。

图3　有机氮源添加量对木糖醇转化率的影响Fig.3 Effect of organic nitrogen source addition on the conversion rate of xylitol

由图3可知，当有机氮源添加量为0～5%时，随着有机氮源添加量的逐渐增加，木糖醇转化率明显升高，这主要是因为发酵液中有机氮源添加量过低时，不能满足菌体大量生长的需求，菌体浓度较低，致使木糖醇转化率偏低；当有机氮源添加量为5%时，木糖醇转化率达到最大值，为45.3%；当继续添加氮源＞5%时，木糖醇转化率变化不大。因此，从节约成本角度考虑，本试验选择有机氮源添加量为5%。

2.1.4初始pH对木糖醇转化率的影响

初始pH对木糖醇转化率的影响，结果见图4。

由图4可知，当初始pH 4.0时，木糖醇转化率偏低，这可能是由于发酵液中存在大量未解离的乙酸分子，强烈地抑制了菌体生长和木糖醇的代谢积累［15］；当初始pH值从4.5升至5.5时，木糖醇转化率先缓慢升高后又缓慢降低，当初始pH 5.0时，木糖醇转化率达到最大值，为45.1%。木糖醇转化率随着初始pH值变化不明显，可见初始pH值对发酵效果影响较小。因此，固定初始pH值为5.0进行后续试验。

图4　初始pH对木糖醇转化率的影响Fig.4 Effect of initial pH on the conversion rate of xylitol

2.2响应面试验分析

采用响应面试验对接种量、装液量和有机氮源添加量进行优化，以木糖醇转化率（Y）为响应值，响应面试验设计与结果见表2。回归模型的方差分析结果见表3。

表2　响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiments

针对表2结果，应用Design Expert 7.0软件进行回归分析，建立多元二次回归方程如下：

由表3可知，回归模型P＜0.000 1，表明该回归模型达到极显著水平，说明方程对试验拟合较好。模型失拟项P=0.552 1＞0.05，不显著，说明该模型能够很好地对响应值进行分析和预测。模型复相关系数R2=0.976 7，表示有97.67%的响应值变化可用该模型来解释，说明试验可靠性较高，故此模型可以用来估计试验结果。回归方程各项方差分析表明，因素A、B、C、A2和B2对木糖醇转化率的影响均极显著（P＜0.01），因素AB、AC、BC对木糖醇转化率影响不显著P＞0.05）。各因素对木糖醇转化率的影响依次是B（接种量）＞A（有机氮源添加量）＞C（装液量）。

表3　回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

为进一步直观分析响应面优化效果，根据回归模型绘制各因素交互作用对木糖醇转化率的响应曲面和等高线图，结果见图5。响应面及其等高线的形状可直观反映各因素间的交互作用对木糖醇转化率的影响，可明显看出它们的等高线基本呈圆形，且曲面坡度较平缓，所以交互作用均不显著［17］，但它们对响应值的交互影响顺序为：AC＞AB＞BC。通过对模型方程分析得出酒糟水解液发酵产生木糖醇的最佳工艺条件为：接种量15.77%、有机氮源添加量4.84%、装液量109.13 mL/250 mL。

图5　接种量、装液量和有机氮源添加量交互作用对木糖醇转化率影响的响应曲面和等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum，liquid volume and organic nitrogen source addition on the conversion rate of xylitol

2.3最佳条件的验证试验

将得出的最佳工艺条件修正为：接种量16%、有机氮源添加量5%、装液量109 mL/250 mL，在此条件下，进行3次验证试验，木糖醇转化率的平均值为57.8%，与预测值（60.4%）相接近，说明采用响应面法优化得到的木糖醇发酵条件可信，此模型准确可靠，具有一定实用价值。

3　结论

本研究通过单因素试验和响应面分析得到热带假丝酵母（C.tropicalis）GIM2.7发酵酒糟水解液生产木糖醇的最佳工艺条件为：初始pH5.0、接种量16%、有机氮源添加量5%、装液量109 mL/250 mL。在此条件下，木糖醇转化率可达到57.8%，与预测值（60.4%）相接近。结果表明，响应面优化酒糟水解液生产木糖醇的发酵条件是有效的，对提高木糖醇的生产提供了技术支持，并且有利于酒糟的合理利用。

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WANG Hao，LI Yanzhang，LI Ying，ZHAO Liang，SONG Jian，JIA Shifang*
（College of Chemical and Biological Engineering，Taiyuan University of Science and Technology，Taiyuan 030000，China）

The optimum conditions of xylitol fermentation from vinasse hydrolysate byCandida tropicalisGIM2.7 were researched to improve the utilization rate of vinasse resources.On the basis of single factor experiment results，the main factors including inoculum，liquid volume，nitrogen source addition were optimized by response surface methodology.The results showed that in the optimum conditions of inoculum 16%，organic nitrogen source addition 5%，and liquid volume 109 ml/250 ml，the conversion rate of xylitol was up to 57.8%，which was approached with predicted value（60.4%）.Results indicated that it was a very effective method to optimize fermentation conditions of producing xylitol from vinasse hydrolysate by response surface methodology.

vinasse hydrolysate；xylitol；fermentation；Candida tropicalis；response surface methodology

TQ923

0254-5071（2016）06-0113-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.024