耐高糖酵母筛选及其高糖胁迫机制的研究进展

朱宝生，刘功良，2*，白卫东，2，颜晓青

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225；2.广州市广式传统食品加工与安全控制重点实验室，广东广州510225）

耐高糖酵母筛选及其高糖胁迫机制的研究进展

朱宝生1，刘功良1，2*，白卫东1，2，颜晓青1

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225；2.广州市广式传统食品加工与安全控制重点实验室，广东广州510225）

耐高糖酵母菌在浓醪酒精发酵过程中起着重要的作用。目前，国内外对耐高酒精度酵母菌有较为广泛深入的研究，而对耐高糖酵母菌的研究还尚有不足。该文介绍了耐高糖酵母的筛选及其高糖胁迫应急机制的研究进展，并对耐高糖酵母的发展趋势进行展望，指出酒精发酵所需酵母菌应生理耐受性较好，能耐高糖度、高酒度、高渗压等，能够抵抗极端不良环境，在工业生产中能够有效提高乙醇的产量。通过筛选耐高糖酵母菌，旨在为酵母菌高糖胁迫机理的研究提供参考。

筛选；驯化；基因；高糖胁迫；机制

耐高糖酵母是一种能够在含高浓度糖的环境中进行生长、发酵产生乙醇和二氧化碳的真菌，其转化能力强，繁殖能力快，能够在高渗的恶劣环境中进行发酵［1-3］。浓醪发酵是酒精工业生产的新趋势，这种发酵工艺所生成的酒精浓度较高，同时醪液中的糖度也高，具有很好的应用价值［4-5］。在发酵初期高浓度底物（如葡萄糖）以及后期逐渐积累的乙醇所产生的各种压力会对细胞产生毒害作用，致使酵母细胞内水分活度、细胞质组成发生显著变化，导致细胞膜和胞内酶受到破坏，从而抑制酵母的生长，导致发酵延后，影响发酵产量［6-7］。提高酵母耐受能力，降低产物对酵母发酵的毒害作用和高渗透压对细胞的抑制作用，是提高发酵效率、降低成本的关键。

酵母菌本身存在一套系统对渗透压进行调节，在高糖胁迫下存在多种信号传导途径和分子应答机制［8-11］。由于酵母渗透压调节系统的表达方式和强弱程度不同，对外界环境表现出的耐高糖性能也有明显差异，而且，来源不同的酵母，其耐受高浓度糖的性能也会有差别［12-16］。因此，耐高糖酵母的筛选是开展耐受机制研究的基础。酵母菌耐受高糖机制的研究对指导菌株改造和探讨酵母细胞生命现象具有重要意义。

1　筛选方法

在筛选耐高糖酵母菌的过程中最为重要的就是选择高浓度糖环境，从高糖环境中筛选出来的酵母菌必然是耐受高糖的酵母菌，现有的耐高糖酵母多数来源于果汁、甘蔗糖蜜、酒精发酵醪液等样品。耐高糖酵母的筛选方法主要有三种：自然筛选、诱变育种和基因工程育种。

1.1自然筛选

菌种在自然的生态环境中、漫长的时间里，通过不断的变异、进化，适应环境的变化，而发生性能上的改变，不需要人为手段去改造而筛选出满足人类意愿的方法就是自然筛选，又叫自然突变筛选。自然筛选是获得耐高糖酵母的途径之一，取材于自然，来源广泛。从自样品中筛选较理想生产菌种的一般步骤：采集菌样→富集培养→菌种分离→性能鉴定。

邱巨香等［17］从中蜂蜜与意蜂蜜中筛选获得耐高糖酵母菌且都为鲁氏结合酵母。王英等［18］采用镜检和杜氏管发酵法初筛，分离出19株酵母菌，通过产酒精能力和耐性能力测试进行复筛，最终确定LM-8为最优酵母，从自然发酵蓝莓果酒中分离筛选出优良酵母。齐向辉等［19］在耐高糖鉴定及其产多元醇分析中利用高糖选择性富集培养技术，从天然高糖蜂巢和蜂蜜环境中筛选到99株耐高糖酵母菌。

1.2诱变育种

诱变育种是在人为的条件下，利用物理、化学的因素，诱变生物产生突变，从中选择培育新的微生物。这种方法基本上建立于逐步提高培养基中糖浓度方法的基础上。最为常用的是通过诱变对出发酵母菌耐高糖性能进行人工筛选驯化。诱变育种的一般步骤：自然筛选→富集培养菌种分离→菌种纯化→人工诱变→逐级筛选→性能鉴定。根据诱变的方式，可分成紫外线诱变和自然驯化。

1.2.1紫外线诱变

在酵母菌的分离筛选中，最常用的是紫外线诱变法，该方法操作简单，出现正突变的机率很高。赵硕等［1］以实验室保存的酵母菌株作为出发菌，采用紫外诱变和驯化，筛选能应用于苹果酒发酵的酵母菌。结果表明，最佳的诱变条件是在15 W紫外灯，照射距离20 cm，照射时间40 s等，在该条件下最终筛选出的2株目的菌株，在65%的糖度下仍能发酵，且结果良好，5 d后酒精度达11%vol以上。徐日益等［20］以酿酒酵母AS2.1189为出发菌，经过紫外诱变100代，筛选得到耐高渗性能较好的B2和A17菌株。

1.2.2自然驯化

自然驯化是酵母菌筛选最基本的筛选方法，该方法可操作性强，方向性明确。张勇等［21］通过逐步提高培养液浓度的方法，将AS2612、AS2614、AS2400、AS2420四种酵母，分别定向驯化成DP1、DP2、DP3、DP4四株耐高渗的适宜酿制蜂蜜酒的酵母，经发酵力对比试验和酿制蜂蜜酒实验，结果表明，DP酵母的发酵力显著提高，发酵蜜酒的周期缩短了一倍以上，成品酒风味更佳。田景芝等［22］以蜂蜜为原料，从蜂蜜中获的野生出发酵母菌，分别制备糖度为15%、20%、25%、30%、35%五个梯度，将已制备好的菌悬液加入五种蜂蜜溶液中进行发酵，筛选出耐受糖度为30%的酵母菌。还利用实验室保存酵母A1、A2、A3按照糖度逐级递升的原理驯化出耐39BX-40BX的酵母。熊雅兰等［23］通过对野生型甘蔗糖蜜发酵高产乙醇菌株MF1002的呼吸突变菌株MF15C进行驯化，发现MF15C比MF1002耐高糖发酵效果要好。

1.3基因工程育种

紫外线辐射和自然突变诱导，筛选工作量大，突变具有多样性，不稳定性，筛选时有点盲目，效果比较差。随着基因技术的发展，基因工程育种渐渐的被人们认可，该方法可操作性强，目的性明确，效果好。

基因工程育种是利用基因重组、克隆等基因工程技术对菌种进行改造，获得目的菌种的方法。基因工程育种的一般步骤：自然筛选→富集培养菌种分离→菌种纯化→基因工程育种→逐级筛选→性能鉴定。

沈玉平［24］通过在god基因前端插入起胞外分泌作用的α-淀粉酶信号肽系列，使酶能够高效分泌到胞外，通过基因组改组酶控，获得能够耐受高初始糖，高温条件下的发酵菌株。张晓阳等［25］通过代谢工程与全基因组重组构建成酿酒酵母抗逆高产乙醇。

2　耐高糖机制

目前，酵母菌耐高糖机制的研究主要包括应激物代谢机制研究、氧化应激机制研究及刚兴起的基因耐性机制研究。

2.1应激物代谢机制

MORAN J W等［26］发现耐高渗酵母具有活跃的磷酸戊糖途径，能够通过胞内累计海藻糖等相容性物质来适应不同的发酵环境。李晓军等［27］研究了指数生长期的酿酒酵母在高渗胁迫下的生理代谢，研究结果表明，甘油和海藻糖是酿酒酵母的主要相容性溶质。在30%高糖环境下，胞外酒精质量浓度、甘油质量浓度、海藻糖质量浓度分别较对照提高100%、400%和11%。彭郦等［28-29］研究了在高糖培养基条件下酿酒活性干酵母AWRIR2的生长及胞内海藻糖代谢情况。结果表明在180～400 g/L的高葡萄糖含量下酿酒酵母均能正常生长，其中300 g/L条件下酿酒酵母生长良好。随着初始糖浓度增加，胞内海藻糖量迅速增加，在400 g/L的葡萄糖含量下，胞内海藻糖积累量达48.73 mg/g（湿质量）。同时，还研究了高糖胁迫下低温对酿酒酵母AWRIR2生理特性的影响。其结果表明，20℃时不同高糖量（250 g/L、300 g/L、350 g/L）对酿酒酵母细胞生长、底物消耗及海藻糖积累影响不同。海藻糖积累量明显高于对照组，说明该菌株有较高的抗高渗能力。20℃低温条件下，海藻糖积累均高于25℃和30℃。对于酵母细胞来说20℃也是逆境刺激，但低温与高渗环境对酵母的协同作用机理还有待进一步研究。苗君［30］采用无氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）培养基，在高浓度糖条件下（葡萄糖组YNB培养基+20%葡萄糖或果糖）培养细胞，同时检测细胞内蛋白和胞外分泌蛋白以及胞外有机酸的代谢变化。研究结果表明，酿酒酵母2144在高浓度糖条件下培养，对数生长期降糖迅速，进入稳定期后降糖开始稳定；培养液的pH值与正常相比初期下降速度较快，进入稳定期后趋势基本一致；酵母细胞内海藻糖含量随糖浓度的增加迅速积累；酵母胞内外甘油含量迅速增加，正常条件培养细胞的甘油含量基本不变。酵母在极端高浓度糖条件下生长，为了适应环境的变化，细胞内蛋白的代谢发生变化，出现了蛋白条带的增加和消失。特别是胞外的分泌蛋白，小分子量分泌蛋白差异性很明显。酵母中苹果酸、柠檬酸、乳酸和α-酮戊二酸4种胞外有机酸的代谢受到了高糖浓度的影响，代谢变化趋势差异性很大。ABERTNY J等［31］认为细胞通过相容性溶质甘油主动调节胞内物质的浓度来适应这种高糖浓度环境。

2.2氧化应激机制

熊雅兰等［23，32］通过测定在30%高糖胁迫下菌株的生长速率、出芽率、乙醇产量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力以及细胞质和线粒体的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶活力，研究了野生型甘蔗糖蜜发酵高产乙醇菌株MF1002及其糖分利用能力显著提高的呼吸突变菌株MF15C在高糖胁迫下的生理特性变化。研究结果表明，糖分利用能力显著提高的酿酒酵母呼吸突变体MF15C较始发菌株MF1002具有更强的高糖耐受性受高糖胁迫时，两菌株的胞内SOD、胞内过氧化氢酶、胞内过氧化物酶、细胞质ATP酶和线粒体ATP酶等的活力均显著上升，并指出这4种酶均参与了酿酒酵母的高糖胁迫反应，其活性可能与MF15C菌株的高糖耐受能力有关，可作为指导进一步改造该菌株的生理指标。

2.3基因耐性机制

随着基因技术的发展，耐高糖酵母基因耐性机制的研究越来越受关注。张晓阳等［25］将酿酒酵母海藻糖代谢工程与全基因重组技术相结合，获得具有较高耐糖性和优良乙醇发酵性能的酿酒酵母菌株，并认为海藻糖代谢工程与杂交介导的全基因组重组相结合的技术途径可提高酿酒酵母抗逆生长与乙醇发酵性能。在270 g/L的高葡萄糖浓度发酵条件下，3株二倍体工程菌（Z12ptpsl、Z12△athl、Z12pT△A）与原始出发二倍体菌株Zd4比较，主发酵速率分别提高9.9%、8.3%、11.4%，乙醇产量依次分别提高4.9%、3.9%、7.0%，与其胞内海藻糖含量高于其他菌株、在胁迫条件下具有更强耐逆境能力相一致。STEFAN H［14］发现海藻糖合成酶基因依赖C-AMP蛋白质激酶的基因、酪氨酸磷酸酶基因、3-磷酸甘油脱氢酶基因，还有sho1、sln1、hog1、roc2、ssk1、ssk2、ssk22、rck2、ptc1、ptc2等基因。LAM F H［33］通过增强S288C的PMA1基因和TRK1基因的表达，提高了酵母菌耐高糖和耐高乙醇性能。

3　结语与展望

目前，酵母在高糖胁迫下应激代谢机制及氧化应激机制已是当下耐高糖机制研究的重点。开展耐高糖酵母研究所用到的糖度均在30%～60%范围内［2，34］，对于60%糖度以上的耐高糖酵母及其耐受研究尚少见报道；现有的酵母菌耐高糖机制研究都固定在某一个浓度开展［2，4］，不同浓度高糖胁迫下应激机制研究尚属空白。因此，酵母耐受高糖的机制研究仍需进一步深入开展。

此外，对微生物耐高糖胁迫机制的研究都只是局限于分子水平，通过研究只是发现耐高糖酵母菌和产生于胞外相容性物质例如海藻糖、甘油、有机酸等对酵母菌耐高糖胁迫有一定的相关性，而无法完全清楚阐述酵母菌耐高糖机制，若能发现一株耐高糖的酵母菌，通过DNA提取、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增、质粒酶切电泳、比对基因库等一系列手段对耐高糖酵母进行基因测序，再对与酵母耐高糖性能相关的基因进行敲除，设置几组实验，通过比较未敲除基因后的酵母与敲除相关基因的酵母在高糖环境下的起酵能力，来验证酵母的耐高糖作用基因。测定后的作用基因可经体外DNA重组技术处理，改造现有的非耐高糖酵母以获得耐高糖性能，测定重组后酵母菌的稳定性，从而可从基因水平阐述其耐高糖机制。

氧化应激机制和代谢物应激机制是当前微生物耐高糖胁迫机制研究最主要的两大方面内容。酵母菌氧化应激机制表达即酒精酵母受胞内SOD、胞内过氧化氢酶、胞内过氧化物酶、细胞质ATP酶和线粒体ATP酶等酶活的影响，乙醇产量发生动态变化。酵母菌应激物代谢机制主要是酵母受某些代谢物影响，乙醇的产量变化。而这些代谢应激物主要有胞外甘油、胞内海藻糖和胞外有机酸。酶是氧化应激机制的关键，而代谢应激物是应激物代谢机制的关键。目前，这两大机制方面都取得了较大的进展。但是，对这两大机制的关系还不甚了解，若把氧化应激机制的酶活测定和代谢物应激机制的代谢物放于糖酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖途径等构建的代谢网络中进行研究分析，测定酶、代谢物种类、含量，进行定性和定量分析，通过方程拟合，模型建立，将酶和代谢物关系化、线性化，更能深刻的揭示酵母菌耐高胁迫机制的研究。

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ZHU Baosheng1，LIU Gongliang1，2*，BAI Weidong1，2，YAN Xiaoqing1
（1.College of Light Industry and Food，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China；2.Key laboratory of Traditional Cantonese Food Processing and Safety Control，Guangzhou 510225，China）

High-sugar-tolerant yeasts play an important role in the process of thick mash alcoholic fermentation.At present，the high-ethanol-tolerant yeasts have an in-depth study home and broad，but lack of study on high-sugar-tolerant yeast.In this paper，the screening of high-sugar-tolerant yeast and the research on high sugar stress mechanism were introduced.The development trend of the high-sugar-tolerant yeast was forecasted.The paper pointed out that yeast used in alcoholic fermentation should have better physiological tolerance，such as high sugar tolerance，high alcohol tolerance，and high osmotic pressure tolerance，etc.To withstand extreme adverse environment，the high-sugar-tolerant yeast is important in improving the industrial production of ethanol content.Screening of high-sugar-tolerant yeast will provide a reference for the research about high sugar stress mechanism.

screening；domestication；gene；high sugar stress；mechanism

TS201.3

0254-5071（2016）06-0011-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.003

2016-01-06

广东省自然科学基金项目（2015A030313598）；广东省高等学校优秀青年教师培养计划项目（YQ2015094）；广东省普通高校特色创新项目（2015KTSCX068）；广州市科技计划项目（201509010005）；广东普通高校省级重大科研项目［粤教科函［2015］3号］；广东省省部产学研合作专项（2013B090600157）；广东省省级大学生创新创业训练计划项目（201411347056）

朱宝生（1990-），男，硕士研究生，研究方向为发酵工程。

刘功良（1980-），男，副教授，博士，研究方向为发酵工程。