纳豆激酶的制备及其改性研究进展

2016-10-14季顺利蔡俊秀崔青钱炳俊姚晓敏张建华

中国酿造 2016年6期

关键词：纳豆酶原枯草

季顺利，蔡俊秀，崔青，钱炳俊，姚晓敏，张建华*

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海200240；2.福建省湄州湾职业技术学院海洋与环境学院，福建莆田351254）

纳豆激酶的制备及其改性研究进展

季顺利1，蔡俊秀2，崔青1，钱炳俊1，姚晓敏1，张建华1*

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海200240；2.福建省湄州湾职业技术学院海洋与环境学院，福建莆田351254）

纳豆激酶（EC 3.4.21.62）是纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）发酵产生的一种丝氨酸蛋白酶，在体外和体内均具有强烈的纤维蛋白溶解活性。提高纳豆激酶的产量及其稳定性和经口服后的生物利用度具有重要的研究意义，该文综述了野生菌、基因工程菌及动植物细胞发酵/培养制备纳豆激酶的方法，及其稳定性和生物利用度等性能改善方面的研究进展，并对纳豆激酶研究的发展前景进行了展望。

纳豆激酶；制备；改性

纳豆激酶（nattokinase，NK）EC 3.4.21.62是由275个氨基酸残基组成的多肽，分子质量为27.7 ku，等电点（isoelectric point，pI）为8.6。它是存在于纳豆中的一种具有强烈纤维蛋白溶解活性的丝氨酸蛋白酶［1］，同时还具有促进血液流动、防止血小板凝聚和降血压等功效［2-3］。

在人体中，血纤维蛋白原在凝血酶作用下，形成血纤维蛋白单体，在凝血因子XIIIa的催化下，血纤维蛋白单体分子间发生共价交联，生成二聚体和多聚体，从而形成血凝块［4］，构成了血栓的主要组成。健康的人体可生成适量的纤维蛋白酶原和组织型纤维蛋白酶原激活剂（tissue plasminogen activator，t-PA）将组织纤维蛋白酶原激活，从而预防血栓症。但血栓症患者体内t-PA和组织纤维蛋白酶原的生成量不足，因此必须使用溶栓剂。溶栓剂分为两大类：一类是组织型纤维蛋白酶原激活剂（如t-PA和尿激酶）；另一类是类组织纤维蛋白酶的蛋白（如NK和蚓激酶［5］）。激活剂类药物的缺点是，它们高度依赖体内组织纤维蛋白酶原的水平，且在体内的半衰期短，因此阈剂量大。NK有类似于组织纤维蛋白酶的特点，能直接溶解血栓［6］，而且它亦可以将组织纤维蛋白酶原分解为组织纤维蛋白酶，并能提高天然t-PA的生成量［7］。提高NK的产量及其经口服后的生物利用度对其应用和研究其体内溶血栓机理都非常重要，本文主要就NK的制备及其改性方面的研究进展进行了综述，为今后NK的开发和对其溶栓机理的研究提供理论依据。

1　纳豆激酶的制备

传统的NK是从固态发酵豆制品（如纳豆、豆豉、豆酱等）或其他发酵产品（如虾酱）中提取的。1992年，NAKAMURA T等［8］克隆得到编码NK的aprN基因后，利用基因工程菌液态或固态发酵生产出NK，成为NK新的制备方式，如表1所示。

1.1野生型枯草芽孢杆菌发酵产NK

产NK的枯草芽孢杆菌（B.subtilis）大多是从自然发酵的纳豆［9-10］或其他大豆发酵产品［12，27］中分离获得，也可从菌种保藏机构获得［11，14］。KU T W等［9-11，14］分别优化了枯草芽孢杆菌的产酶发酵条件，最终发酵液中NK的酶活分别为13.69 SU/mL、587 U/mL（四肽底物法）和3 194.25 U/mL日本纳豆协会测定法（Japan bio science laboratory，JBSL）。当LB液体培养基中添加天冬氨酸（Asp）、谷氨酰胺（Gln）或谷氨酸（Glu）时，NK的产量可提高70%～95%；当同时添加Glu和11种金属离子混合物时，可使NK的表达量增加4倍［19］。也有研究者利用其他菌株发酵产生具有相似功能的酶，如WANG S L等［21］利用从土壤中分离的假单孢菌（Pseudomonassp.）TKU015发酵虾壳获得的分子质量分别为21 ku和24 ku的具有溶栓功能的丝氨酸蛋白酶。

表1　纳豆激酶的制备Table 1 Production of nattokinase

1.2基因工程菌发酵产NK

作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的模式菌，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌是NK表达研究最集中的宿主菌。大肠杆菌（E.coli）表达的NK通常为不溶的包涵体形式，但CHIANG C J等［28］通过将NK与油质蛋白融合表达，并将表达蛋白置于含有甘三酯和磷脂等成分的人工油体中复性，可获得有活性的蛋白；而LIANG X B等［22］利用一个协助胞外质表达的启动子pelB，实现了NK在大肠杆菌中胞外的可溶性表达，但与枯草芽孢杆菌相比较，表达量相对较低。

NK在枯草芽孢杆菌中可实现可溶性表达，CHEN P T等［18］通过发酵条件优化，利用枯草芽孢杆菌工程菌摇床培养和发酵罐培养表达NK，其酶活分别为71 500 CU/mL和77400CU/mL。WUSM等［20］构建了枯草芽孢杆菌工程菌，并通过优化启动子使NK的表达量增加了136%，达1 999 U/mL（平板法）。

除枯草芽孢杆菌和大肠杆菌外，其他细菌及动植物细胞也被用来表达NK。WEI X T等［23］利用一般公认为安全的地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）作宿主菌，通过敲除编码8个胞外蛋白酶的10个基因，并优化信号肽，构建了高产NK的地衣芽孢杆菌工程菌。LIANG X B等［24］利用乳酸链球菌肽（nisin）的抗性基因作为筛选标记，以乳酸菌的模式菌株乳酸乳球菌（lactococcus lactis）为宿主菌构建了表达NK的食品级菌株。LI X X等［25］通过将绿色荧光蛋白和NK融合在草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞内进行可溶性表达，酶活性达60 U/mL。HAN L等［26］基于植物偏爱密码子，通过合成获得了NK的编码基因，采用植物果实特异性启动子E8，使NK在甜瓜（Cucumis meloL.）中表达，最高酶活达79.3 U/mL。尽管对不同菌株发酵或动植物细胞培养制备NK的报道很多，但NK测定方法不统一，给不同研究间的比较带来困难。

2　纳豆激酶的性能改善

NK属于大分子化合物，在贮藏过程中易失活，因此需提高其贮藏稳定性。另外，NK是口服摄入，需要经胃肠道消化吸收，所以其在消化系统中的稳定性非常重要。NK这两方面性质的改善可通过以下方式来实现。

2.1物理包埋

赋形剂（多聚物）可保护生物大分子不被胃的极端pH和蛋白酶破坏。对NK包埋的赋形剂通常选择大分子形成脂质体、微乳液或固体压片，以对酶进行保护，使其在贮藏条件下或胃液中稳定。LAW D等［29］先将NK粉末压成小片，再用肠溶性包衣材料EudragitRL 100-55和羟丙基纤维素通过压缩涂在表面，压力在400 MPa以下不会引起酶变性，NK片剂在人工胃液中2 h不变性，而在人工肠液中5 h被完全释放。DONG X Y等［30］以卵磷脂、植物甾醇和甘露醇等为辅料，通过配比调整，实现了对NK的有效包埋。WEI X T等［17］利用甲基丙烯酸-乙烷基丙烯酸盐共聚物对NK进行包埋，使之能在胃中受到保护，并在肠液中释放。

物理包埋还有缓释及提高酶稳定性的效果，可显著提高包埋物在肠内的溶解率，促进包埋物在特异性细胞位点的吸收，从而提高其生物利用率。黄银娟［31］以可溶性淀粉为原料，采用反相微乳液法制备阴离子型淀粉纳米粒，对NK具有保护和控制释放的作用，可作为NK的潜在载体。HSIEH C W等［32］用高分子量的γ-多聚谷氨酸钠包埋NK后，明显提高了其在60℃和低pH条件下的稳定性。CHEN C等［33］合成了叶酸改性的壳聚糖（chitosn-folate，CS-FA），制备了不同质量比的系列NK/CS-FA复合物。体外溶血栓实验结果表明，NK/CS-FA复合物在溶栓活性和稳定性方面具有明显的优势，且叶酸可促进吸收NK。

2.2纳米粒子结合

纳米粒子（nano particle，NP）不仅能穿过组织间隙，还可通过人体最小的毛细血管，甚至可通过血脑屏障被细胞吸收。NP还具有靶向、缓释、高效和低毒等许多优点，且可实现口服、静脉注射及敷贴等多种给药途径。NP结合NK的应用除了可以利用磁性NP从发酵液中纯化NK外，对NK的改性方面还具有以下作用：

（1）NK与NP结合后稳定性提高。WEI X T等［34］利用纳米银粒子（AgNPs）与NK形成纳豆激酶-纳米银粒子（NK-fAgNPs），NK-AgNPs的热稳定性和抗凝效果都有所提高。通过静电引力与聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）逐层自组装形成包被层，该包被复合物（NK-AgNPs-PEI）具有良好的纤溶效果。DEEPAK V等［35］利用聚羟基丁酸酯NP固定化NK，酶活提高了20%。固定化同样可促进酶稳定性的提高，在4 ℃下贮藏25 d，NK酶活仍能完全保持。KAPOOR R等［36］制备了NK壳聚糖NP，结果表明，NK不仅稳定且有缓释效果，而小鼠卡拉胶诱导凝血实验证明NK-NP的效果显著优于游离的NK。凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化的部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）和纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）等凝血指标的测定结果同样表明NK-NP的效果显著优于游离的NK。

（2）利于口服时保护NK顺利通过胃肠道，达到靶向输送的目的。在生物医药方面应用的NP必须具有良好的生物相容性、低毒性和表面易于改造从而与药物结合等性质，为达到靶向输送的目的还需要有电性或磁性等。LI C M等［37］将聚异丙基丙烯酰胺（poly（N-isopropylacrylamide），PNIPAAm）和聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA）共价接枝到的微米级或纳米级的聚丙烯（polypropylene，PP）表面，形成刷状表面。甘露糖结合蛋白-伴刀豆球蛋白通过活化的羧基被共价结合固定在刷状接枝表面。NK被红细胞（red blood cell，RBC）包埋，RBC通过其表面的甘露糖与伴刀豆球蛋白接合。经改良的超疏水的聚丙烯能吸附的RBC比平的聚丙烯多7倍，且包埋的NK有缓释效果。RBC包埋的物质不仅具有缓释效果还提高了包埋物的生物相容性。LAW D等［38］用虫漆包埋NK形成小粒，在胃中不被分解而在肠液中释放，达到了靶向输送的目的。

2.3分子改性

对NK的分子改性是建立在酶的结构和功能基因分析的基础之上。NK的晶体结构在2013年首次被YANAGISAWA Y等［39］通过X射线衍射揭示。WU S等［40］通过对Gly100、Ser101和Leu126三个位点进行定点突变，证实如果在100位上是体积大的或带正电荷的侧链，则底物结合和催化活性会大幅度下降；而这类残基若位于101位则能明显提高NK的蛋白酶和溶栓活性，Leu126的突变会破坏活性中心的结构，从而使酶活大幅度下降。ZHENG Z L等［41］通过定点突变确认Ser33、Asp 60和Ser 62及Thr 220是酶的催化位点，突变后自由能增加，催化效率降低。

对NK的分子改性可以提高酶的活性和稳定性。CAI Y J等［42］通过对纳豆芽孢菌AS 1.107、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CICC 20164和地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）CICC 10092三个菌株的同源基因进行DNA shuffling建立了一个突变子库，通过平板法筛选到催化效率比野生型提高2.3倍的NK突变体。刘朔等［43］发现原生质体紫外诱变产生的纳豆芽孢杆菌NK突变体D36G在65℃处理15 min后，热稳定性提高了20%，比活力提高了16.6%。WENG M Z等［44］通过定点突变发现L31I的催化效率是野生酶的2倍。双突变M222A/I31L和T220S/I31L的酶活明显高于单突变，且M222A/I31L的氧化稳定性也高于野生酶。

3　展望

综上所述，NK的制备和改性方面的研究已经取得了很好的进展，鉴于NK是生物大分子，且多采用经口摄入，可以推断将来的研究热点主要集中在以下两个方面：

（1）建立NK酶活性测定的标准方法。尽管NK制备和表达方面的研究已经很广泛，但NK酶活性测定至今仍没有标准方法，给不同研究结果间的相互比较带来了一定的困难。常用的NK测定方法主要有以尿激酶为对照的平板法，四肽底物法、日本生物技术研究所（Nippon institute for biological science，JBSL）的方法，另外还有酪蛋白水解法等。因为四肽底物法主要是考察NK水解酰胺键的能力，而且尿激酶和NK对水解底物的特异性有差异，所以平板法和四肽底物法之间并无相关关系。而JBSL法现在还处于保密阶段，日本纳豆协会提供的简易方法误差较大。

（2）对NK溶栓机理的研究。尽管诸多动物实验和人体实验证实了NK的溶血栓、降血压等功效，但NK是分子质量为27.6 ku的生物大分子，现有的产品形式和食用方法在很大程度上并不能预防其在胃肠道中的水解。即使是物理改性的NK，作为完整分子在小肠中的吸收量也是很低的。所以NK的溶栓机理并不是很清楚。当前NK的酶活性测定方法都是体外考察酶的水解能力，其活性高低是否能真正反映NK在体内的功效，这些疑问的解答将对NK的研究及产品开发有指导作用。

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JI Shunli1，CAI Junxiu2，CUI Qing1，QIAN Bingjun1，YAO Xiaomin1，ZHANG Jianhua1*
（1.College of Agriculture and Biology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China；2.College of Ocean and Environment，Meizhouwan Vocational Technology College，Putian 351254，China）

Nattokinase（EC 3.4.21.62）is a kind of serine protease produced byBacillus subtilisnatto，which has strong fibrinolytic activityin vitroand in vivo.Improving the yield，stability and bioavailability of nattokinase has important research significance.The paper reviewed nattokinase preparation by fermentation，culture of wild and genetically engineered strains，and plant and animal cells.The performance improvement including the stability and bioavailability were summarized.The development prospect of nattokinase was expected.

nattokinase；preparation；modification

Q556

0254-5071（2016）06-0006-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.002