食源性混合菌种生物被膜的形成与种间相互作用

范熠，韩北忠，陈晶瑜

（中国农业大学食品科学与营养工程学院食品质量与安全北京实验室，北京100083）

食源性混合菌种生物被膜的形成与种间相互作用

范熠，韩北忠，陈晶瑜*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院食品质量与安全北京实验室，北京100083）

食源性微生物形成的生物被膜是食品生产加工中不容忽视的安全隐患，针对食品生产加工环境中广泛存在的混合菌种生物被膜的研究仍处于起步阶段。该文在现有的理论和研究结果基础上，总结了食源性混合菌种生物被膜的形成规律，归纳介绍了混合被膜中微生物间以竞争和共生为主的种间相互作用及其调控机制，旨在为食品领域混合菌种生物被膜的研究提供借鉴。

混合菌种；生物被膜；相互作用；食品安全

无论在发达国家还是在发展中国家，食源性病原微生物引起的感染和中毒一直是困扰公共卫生和食品工业的难题。根据美国疾病控制中心的年度报告，仅在2013年，美国就发生了818起食源性疾病爆发事件，导致了13 360人次入院治疗，16人死亡，14次食品召回事件［1］。美国每年有4.8亿例食源性疾病的病例，其中0.94亿是由于食源性致病菌引起的。研究表明，80%由微生物引起的食品安全事件包括食源性疾病，都是由生物被膜（biofilm）引起的。

1　概述

生物被膜是指微生物粘附于接触表面，分泌胞外多聚物等黏性基质，将自身包裹其中而形成的大量细菌聚集物［2］。生物被膜是微生物为适应生存环境而采取的一种生存方式，自然环境下的生物被膜多是由多种菌种组成的混合菌种生物被膜（以下简称为混合被膜），被膜中的细胞代谢率较低，一些细胞甚至处于休眠状态，故对温度、渗透压、消毒剂、抗生素等的耐受性较游离态细胞更强，与单菌种被膜相比，混合被膜由于其组成菌的多样性，适应环境的能力也更强［3］。在食品生产的过程中，生物被膜可以粘附在食品加工设备表面、管道接口、操作台面等，而且不易被日常清洁措施清除。此外，生物被膜态细菌的代谢活动可以腐蚀设备，减少输送管道的输送容量，降低传热传质效率，增加动力消耗［4］。尤其是食源性病原菌如蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、志贺氏菌（Shigella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella）、单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）等形成的细菌生物被膜，容易引起食品交叉污染，导致食品腐败或疾病传播的隐患，给食品安全带来极大威胁。实际生产中，混合被膜污染严重影响着食品生产与安全。现阶段已有的研究多是以单菌种生物被膜为研究模型，研究生物被膜的形成调控机制、清除方法等。在食品领域生物被膜的研究目前仅仅针对几种典型的食源性致病菌（如金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌等），而且研究多集中于单一菌种纯培养的生物被膜，但是在自然界中，与单一菌种生物被膜相比，混合被膜的存在更为广泛［4］。近年来，学者们也纷纷在实验室建立混合被膜研究模型，期望更进一步揭示生物被膜形成的机理，寻找更高效可行的清除方法。

2　混合被膜的形成

生物被膜的形成过程主要分为三个阶段：被膜起始粘附、被膜的发展、被膜的成熟［4］。与单菌种被膜相比，混合被膜需要更多的时间才能达到成熟期，其成熟期的结构也更为复杂和稳定，对消毒剂的耐受性也普遍较强［5］。故混合被膜的形成较单菌种生物被膜更为复杂，其形成过程分为五个阶段：初始可逆粘附阶段；由群体感应或者分泌胞外多聚物导致的不可逆粘附阶段；微菌落的形成；混合被膜的成熟；最后成熟的被膜脱落和散播［6］。目前公认的胞外多聚物的主要成分为胞外多糖、蛋白质、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonuleic acid，RNA）［7］。

关于混合被膜的形成过程，代表性的假说是在被膜形成菌与载体初始接触粘附时，混合被膜的组成菌分别利用载体表面的营养物质，互不接触，在载体上各自独立生长形成生物被膜，这时的胞间通讯信号分子不需要统一，也不需要被对方识别。而随着微菌落的形成，生物被膜与载体接触的表面积扩大等因素，几种单菌种生物被膜在载体上相重合，在细菌相互作用，胞间通讯，群体感应，环境的胁迫的共同作用下，最终形成稳定的混合被膜。在混合被膜中，对于大多数需氧微生物，位于被膜深层即被膜底部面临着较为残酷的生存环境，底部的氧气稀薄，营养物质需要传送导致底部细菌生长受到限制。故在底部的细菌常为劣势菌种，在被膜顶部的为优势菌种［8］。ALMEIDA C等［9］对食源性三菌种混合被膜结构的观察和研究，在一定程度上佐证了这种理论。肠道沙门氏菌Salmonellaenterica）ATCC13076、大肠杆菌（E.coli）ATCC 5922和单增李斯特氏菌（L.monocytogenes）ATCC 15313这三种细菌形成了显著的双层生物被膜，其中大肠杆菌生长速度最快，产胞外多聚物的能力强，在混合被膜中占据优势位于上层，而另外两种菌则位于底部，生长受到抑制，但其中具体的调控机制还有待进一步研究。

混合菌种被膜的形成，除与菌种有关之外，也受到接触表面性质和营养条件的影响［10］。温度的变化会影响沙门氏菌和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的形成混合被膜，在5℃的条件下，混合被膜的生物量低，活菌数少，其中铜绿假单胞菌为混合被膜中的优势菌，沙门氏菌活菌数很低。而当温度升高至30℃时，混合被膜的生物量和活菌数较5℃有显著增加，尤其是沙门氏菌的活菌数显著增加，成为混合被膜中的优势菌，生物被膜形成能力显著增强［11］。而在铜绿假单胞菌与黄杆菌（Flavobacterium p.）的混合被膜培养中，在外部流速很慢时，营养匮乏，二者表现出竞争关系；当外部流速很快时，营养物质较为充足，两者呈共生关系，胞外多聚物大量积累［12］。温度、营养条件等不仅会影响混和生物被膜的形成，而且对菌种间的相互作用造成了巨大影响，故可以通过设置多重温度、H等环境参数组成的栅栏因子，可以达到控制生物被膜形成的目的。

3　混合菌种被膜中种间相互作用

自然环境中，尤其在是食品生产加工环境中，多种微生物共同存在，所以由多菌种组成的混合被膜更为常见［13］。近年来，越来越多的研究以食源性双菌种混合被膜为研究对象，进一步探究粘附在食品及食品加工器具表面被膜中混合菌种的相互作用以及调控机制（表1）。基于现有的研究，混合被膜中的相互作用主要体现为竞争作用和共生作用［4，8，14］。而混合被膜中微生物的相互作用，是细菌胞间通讯信号交流以及代谢作用的宏观体现。

表1　近5年混合菌种被膜种间相互作用主要研究Table 1 Studies of interspecies interactions within multispecies biofilms in the last five years

3.1竞争作用

由于有限的营养物质以及一些菌种分泌的抑菌物质，混合被膜组成菌间有时存在竞争作用。微生物通过限制营养来源或者产生抑制另一种微生物生长的代谢物，进而弱化细菌与接触表面以及细菌间的相互作用，从而减弱被膜中其他细菌的粘附能力，促进该细菌的脱离与扩散［34］。

而一些产细菌素的菌株，与对细菌素敏感的菌种共培养的过程中，游离态和被膜态的相互作用表现出显著的差异。SUTHERL I W等［35］的研究表明，在游离态混合培养的过程中，产生细菌素的肠杆菌（Enterobacterium）利用细菌素抑制大肠杆菌的生长，倾向于彻底抑制大肠杆菌，将混合培养最终变成单菌种生存，甚至可以用“敌对”来形容这种竞争关系。

3.2共生作用

3.2.1共代谢作用

混合被膜中的菌种间的互利共生表现为共代谢作用或是互养作用。一种微生物利用另一种的代谢副产物生存，会影响混合被膜的结构和性质［36］。HANSEN S K等［37］对恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）和不动杆菌（Acinetobacter）形成的混合被膜的研究发现，由于2种菌代谢水平上的相互作用混合被膜在含苯甲醇环境中的存活率显著提高，不动杆菌将苯甲醇分解为苯甲酸盐，苯甲酸盐可以被恶臭假单胞菌代谢利用，这种互利共生作用提高了生物被膜的生物量，还可能通过改变被膜组成菌的代谢，改变混合被膜的理化性质，从而提高混合被膜会环境的适应能力。而在单增李斯特氏菌和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的研究中发现，单菌种生物被膜对苯扎氯胺的耐受性强于游离态细胞，二者形成的混合菌种被膜的耐受性强于单菌种生物被膜［26］。

3.2.2细菌的共凝集作用

共凝集是无亲缘关系的细菌通过细胞表面分子进行特异性识别进而凝集在一起的行为，在多菌种生物膜的发育与成熟中，共凝集影响了生物膜的形成和生物膜群落的多样性［38］。混合被膜的形成是有细胞表面介导的受体-配体相互作用控制的，共凝集作用会导致混合菌种的被膜形成能力显著提高。其中可以将多种无亲缘的关系的细菌联接在一起，起到桥梁作用的细菌称为架桥细菌（bridging bacterium）［39］。在混合被膜中，具有被膜形成能力的架桥细菌可以与非被膜形成菌发生共凝集作用，将其变成混合被膜的组成菌［39］。大肠杆菌O157（Escherichia coli O157：H7）在单独培养的情况下，很难形成单菌种生物被膜，而将其与铜绿假单胞菌共培养就可以形成生物量较高的混合被膜，分析混合被膜的结构发现，只有1%的底层粘附细胞为大肠杆菌O157，而超过50%的被膜上层细胞为大肠杆菌O157。大肠杆菌O157在具有被膜形成能力的搭桥细菌的帮助下，可以形成混合被膜［40］。

3.3偏利（害）共生

并不是所有的双菌种生物被膜的组成菌都能面对消毒剂并肩作战的，与游离态细菌相互作用一样，在双菌种混合被膜中也存在偏利共生及偏害共生。偏利共生（commensalism）亦称共栖，指种间相互作用对一方没有影响，而对另一方有益（若对一方没有影响，对另一方有害则称偏害共生）。研究表明［40］，从肉品和食品加工器具中分离的单增李斯特氏菌与恶臭假单胞菌组成的混合被膜对苯扎氯胺的耐受性与恶臭假单胞菌的单菌种生物被膜相比有显著提高。但无论是单增李斯特氏菌的单菌种被膜还是和恶臭假单胞菌形成的混合被膜，单增李斯特氏菌对苯扎氯胺的耐受性并没有显著差异。苯扎氯胺处理混合被膜，造成了单增李斯特氏菌的大量死亡，处理之后的混合被膜中90%的组成菌为恶臭假单胞菌。这说明在这种双菌种混合被膜中，更利于恶臭假单胞菌的生存。

3.4群体感应作用

细菌的群体感应（quorum sensing，QS）指微生物某些基因的表达受到与细胞密度相关的信号分子调控的现象［41］。在混合被膜的形成过程中，一种微生物分泌自诱导剂（autoinducer，AI）作为公共信号分子，这个信号分子不仅可以被同种细菌识别也可以被其他被膜组成菌所识别，当AI浓度随着微生物群体密度达到一定阈值时，启动特定基因的表达，调控生物被膜形成。大量的文献证明群体感应可以调控单菌种生物被膜的形成［28，29，42］。

以氨基酸或短肽类为信号分子的QS系统，调控着金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌被膜的形成［28-29］；以N-酰化高丝氨酸内酯（N-acylated homoserine lactones，AHLs）为信号分子的群体感应系统影响以铜绿假单胞菌为代表的革兰氏阴性菌生物被膜的形成［42］；AHL群体感应系统可以作为特定种类细菌的胞间通讯方式，调控混合被膜的形成。铜绿假单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）形成的混合被膜就受到群体感应的调控［43］。在对食源性细菌的研究中，尚未发现QS信号与生物被膜形成之间的相关性［4，44］，食源性混合菌种被膜的形成是否受到群体感应的调控还需要进一步研究。

4　展望

食品领域中生物被膜的相关研究在逐渐深入，但对食源性混合被膜的研究还比较匮乏，综合现有研究，混合被膜的种间相互作用，往往是代谢作用、生理作用、胞间通讯等同时存在，其中机制较为复杂，且与游离态混合培养表现出的相互作用存在极大差异。进一步研究不同环境条件下食源性混合被膜的相互作用机制，将有助于揭示混合被膜的形成规律，有助于为食品生产中生物被膜的控制提供有力的理论支持，以及针对特定的食源性致病菌提出有效的控制方法。

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Formation and interspecies interactions of multi-species bilfilm formed by foodborne bacteria

FAN Yi，HAN Beizhong，CHEN Jingyu*
（Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，College of Food Science&Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083 China）

Food safety risks caused by foodborne bacterial biofilms cannot be ignored.There is lack of researches about multi-species biofilms in food processing environment.The paper summarized current theories about formation rules of multi-species biofilm by foodborne bacteria，introduced microbial interactions such as competition and commensalism within multi-species biofilms，providing

for further studies.

multi-species；biofilm；interaction；food safety

Q939.9

0254-5071（2016）06-0001-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.001

2016-03-10

北京高等学校青年英才计划项目（YETP0310）；国家自然科学基金面上项目（31371716）

范熠（1992-），女，博士研究生，研究方向为食品微生物学。

陈晶瑜（1978-），女，副教授，博士，研究方向为食品微生物学。