新疆生鲜牛乳中兽药残留的快速检测分析

文/范盈盈　陈　贺　王富兰　刘圣红　马　莎　齐新林

〔1新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所；2农业部农产品质量安全风险评估实验室（乌鲁木齐）；3新疆农产品质量安全重点实验室；4新疆农业大学食品科学与药学学院；5.新疆维吾尔自治区奶业办公室〕

新疆生鲜牛乳中兽药残留的快速检测分析

文/范盈盈1，2，3陈贺1，2，3王富兰1，2，3刘圣红1，2，3马莎4齐新林5*

〔1新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所；2农业部农产品质量安全风险评估实验室（乌鲁木齐）；3新疆农产品质量安全重点实验室；4新疆农业大学食品科学与药学学院；5.新疆维吾尔自治区奶业办公室〕

因抗生素类兽药在奶牛中的广泛使用而造成的生鲜乳中兽药残留问题，严重威胁了生鲜乳的质量安全。利用基于胶体金配体-受体识别技术的检测条法对新疆部分乳企、合作社和散户的55 份生鲜牛乳样品进行了八大类兽药残留的初筛，发现存在兽药残留的情况，其中散装奶中兽药残留种类较多。另外，对其中5 份生鲜牛乳中的酰胺醇类兽药采用液相色谱-串联质谱法进行确证。通过比较检测条法和仪器定量法的检测结果，发现检测条法结果准确、操作简单、耗时短且便于携带，特别适用于大量样品的初筛，与仪器定量法联合使用，能大大提高新疆生鲜乳兽药残留评估的工作效率。

生鲜牛乳；兽药残留；检测条

新疆是多民族聚居区，牧民和城乡居民自古以来就有食用乳与乳制品的传统。基于特殊的社情和民情，《新疆维吾尔自治区奶业条例》（2003年通过，2011年修订）允许生散乳直接上市销售，并对其准入条件、市场监管和法律责任等作了明确规定［1］。然而，新疆奶业规模化养殖程度不高，以小规模农场、合作社和个体奶农居多，这部分奶源多以散卖乳的形式进入市场，基本上没有监督、检验措施评价其质量的优劣，导致新疆消费者喜闻乐见的散卖生鲜乳存在着散播传染病、滥用兽药及违禁添加药剂等隐患。其中因抗生素类兽药在奶牛中的广泛使用而造成的生鲜乳中兽药残留问题 ，严重威胁了生鲜乳的质量安全，因此有效的监测和控制生鲜乳中兽药残留的含量，对人们的饮食安全和乳品产业的发展有重要的现实意义。

近年来，兽药残留问题日益受到世界各国及地区的重视，限用和禁用的兽药种类越来越多，限量标准越来越严格。美国规定A级巴氏奶原料奶中没有抗生素残留，对原料奶的抗生素检测为强制性［2］，欧盟亦对最大残留量作了详细的规定［3］。中国主要参考欧盟的标准并结合中国实际国情，也制定了牛奶中限量兽药残留的标准［4］。

目前对兽药残留的检测基本采用高效液相色谱［5］、液相色谱-串联质谱［6］、毛细管电泳［7］等高端实验室仪器分析方法，存在样品前处理要求高、耗时长、需要专业实验室条件和较高水平的技术人员、费用昂贵等缺陷。另外，由于新疆地域广阔，若对全疆的生鲜乳进行全面的兽药残留污染评估，需要采集大量的样品，样品从牧场到实验室需要特殊的储存条件并经历漫长的运输过程，这将耗费大量的人力、物力和财力。因此，在乳品生产第一线，高敏感性的快速检测方法将成为保障乳品安全的最重要的手段。

微生物抑制法快速检测试剂盒［8］、酶联免疫试纸条［9］、胶体金层析技术［10］等是常用的快速检测方法，这些方法大都基于抗原-抗体识别原理，而抗生素类兽药是小分子，难以制备抗体，即使能获得抗体，效价不仅低，而且这些抗体往往只能识别水解后的抗生素而不是抗生素原体。基于配体-受体识别原理的Charm试纸条，虽然机理与抗原-抗体结合的机理基本相同，但是受体可以从大量可能受体中筛选，配体结构可以进行人工修饰以增强结合力，不仅解决了小分子识别问题，还能进行多残留检测。美国从1994年开始一直使用该方法进行生鲜乳中兽药残留风险评估［11］，每年的数据量可达300万份，实验证明该方法是经典、有效、快速、相对准确的生鲜乳中兽药残留风险评估辅助手段。

本试验拟利用基于胶体金配体-受体识别技术的检测条法首次对新疆部分地区的生鲜牛乳样品进行8大类兽药残留的初筛，对于部分疑似阳性样品（以酰胺醇类为例）采用液相色谱-串联质谱法进行确证和精确定量，以期建立一套快速、方便、节约的兽药残留定性、定量方法，为全疆生鲜乳中兽药残留风险评估工作提供技术支撑。

1　材料与方法

1.1材料

共采集生鲜牛乳样品55 份（其中来自T乳业公司11 份、X乳业公司7 份，合作社16 份，其余均来自乌鲁木齐市的散装奶）。样品采集后，当场放入干净采样瓶中，低温运输至实验室，并于当天用Charm检测条全部检测完。剩余样品-20 ℃保存，待用液相色谱-串联质谱检测。

酰胺醇类标准品包括氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素（美国Sigma公司）；甲醇、甲酸、乙腈（均为液相色谱级，美国Thermo Fisher公司）；去离子水由Milli-Q超纯水设备制备（美国Millipore公司）。

Charm QUAD抗生素四合一检测条系列（QUAD1为β-内酰胺、磺胺、喹诺酮、四环素四合一检测条，QUAD2为林可霉素、红霉素、泰乐菌素和庆大霉素四合一检测条，QUAD3为链霉素、大观霉素、卡那霉素和新霉素四合一检测条），Charm 酰胺醇类检测条，Charm Rosa孵育器和Charm EZ抗生素检测仪〔中检环贸生物技术（北京）有限公司〕；微量移液器（德国Eppendorf公司）；0.2 μm滤膜（天津津腾实验设备有限公司）；Acquity UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Micromass Quattro Premier XE三重四级杆串联质谱仪配有电喷雾离子源（美国Waters公司）；XSE分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；漩涡混合器（德国IKA公司）；低温高速离心机（美国Thermo公司）；旋转蒸发仪（德国Heidoph公司）；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（美国Waters公司）。

1.2快速检测条原理

配体-受体胶体金检测条的金标为微生物受体-金标复合物，检测线分别包被有与待测药物结构相似的配体，控制线包被有可结合胶体金颗粒的配体。当样品中含有待测药物时，会与金标复合物竞争结合检测线包被配体，金标复合物与检测线包被配体结合形成红色线，未与检测线包被配体结合的金标复合物移动到控制线与包被有可结合金标复合物的配体结合形成红色线。检测线显色的强度与样品所含药物浓度成反比，通过读数仪内置既定算法获取检测线与控制线光散射型号判定阴阳性。控制线不全或没有颜色为无效检测。

1.3Charm检测条法检测生鲜牛乳中残留的8类兽药

参考检测条说明书，将检测条的粘箔撕开至指示线处，用微型移液器取300 μL混匀的生鲜牛乳样品，竖直缓慢地滴加到检测条的凹槽中，将粘箔重新粘好后，放到Charm Rosa 孵育器上孵育〔对于QUAD1、2和3检测条，孵育温度为（56±1）℃，孵育时间为5 min；对于酰胺醇类检测条，孵育温度为（40±1）℃，孵育时间为8 min〕，同时可孵育4 个检测条。孵育结束后，将检测条放入Charm EZ检测仪中判读结果，若检测仪上的读数（READING）为负值或零，则结果（RESULT）会显示负（Negative），表明结果为阴性。如果READING为正值，则RESULT会显示阳性药物种类信息，如β-内酰胺类（BL）、磺胺类（SLF）、喹诺酮类（QN）等。初步检测为阳性的样品需要重新作复样检测。

1.4液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测疑似阳性生鲜牛乳样品中残留的酰胺醇类兽药［12］1.4.1 样品的前处理

称取1 g（准确至0.01 g）生鲜牛乳于15 mL聚丙烯离心管中，加入3mL乙腈，涡旋30 s，以10 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液于15 mL离心管，再加入1 mL乙腈重复提取沉淀蛋白质部分。将2 次提取液合并，直接通过Oasis PRiME HLB固相萃取柱，在重力作用下收集全部流出液于15 mL聚丙烯离心管中。再取0.5 mL80%乙腈水溶液洗脱固相萃取柱，收集全部洗脱液，35 ℃水浴中旋蒸至约0.6 mL，用水溶液定容至1 mL，涡旋混匀，过0.2 μm滤膜，进行UPLC-MS/MS分析。

1.4.2色谱-质谱条件

（1）色谱条件

色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱温为40 ℃；流动相为乙腈-水溶液，流速为0.5 mL/min；进样量为5 μL。

梯度洗脱条件：0～1 min，维持0%乙腈；1～4 min，从0%乙腈线性升至95%乙腈；4.0～4.1 min，从95%乙腈线性升至100%乙腈；4.1～6.0 min，维持100%乙腈；6.0～6.1 min，从100%乙腈降至0%乙腈；6.1～8.0 min，维持0%乙腈。全程时长8min。

（2）质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI），检测方式为多反应监测（MRM），电喷雾电压为-2 500 V；其它参数见表1。

表1　多反应监测扫描模式的质谱参数

2　结果与讨论

2.1Charm检测条的检测结果分析

生鲜牛乳中8 类兽药（β-内酰胺类、磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、林可胺类、氨基糖苷类和酰胺醇类）残留的Charm检测条法测定结果见表2。

从生鲜牛乳样品数分析，在55 份样品中发现兽药残留的检出样品共有8 份。只检出1 类兽药残留的样品有4 份，其中1 份检出为β-内酰胺类，其余均只检出庆大霉素（属于氨基糖苷类）；检出有2 类兽药共残留的样品数有3 份，1 份是庆大霉素和喹诺酮类共残留，1 份是庆大霉素和红霉素（属于大环内酯类）共残留，另1 份是喹诺酮类与酰胺醇类共残留；检出有3 类兽药（喹诺酮类、庆大霉素和林可胺类）共残留的样品数只有1 份。

从生鲜牛乳样品的来源分析，本试验所采样的乳业公司、合作社和散装奶都有兽药检出，其中只检出1 类兽药的样品来自乳业公司和合作社，检出2 类兽药共残留的样品来自合作社，检出3 类兽药共残留的样品来自散装奶。该结果与新疆巴州地区牛乳中抗生素残留的调查结果［13］相似，即散装奶的阳性率为17%，收购站奶的阳性率仅为4%。

从兽药检出种类分析：氨基糖苷类的检出率最高（10.91%），喹诺酮类的检出率次之（5.45%），β-内酰胺类、大环内酯类、林可胺类和酰胺醇类的检出率最低（均为1.82%），磺胺类、四环素类兽药均没有检出。

2.2液相色谱-串联质谱法的检测结果分析

本试验选择了Charm检测条检出的酰胺醇类阳性样品1 份和阴性样品4 份，用UPLC-MS/MS进行了确证，发现该阳性样品检出的酰胺醇类兽药为氯霉素，并已超过国家限量标准（0.1 μg/kg）；另外4 份阴性样品中有1 份检出氟苯尼考，1 份检出甲砜毒素，但均未超过国家限量标准（50 μg/kg）。Charm检测条与UPLC-MS/MS结果不同的原因是因为仪器的检出限与试纸条的检出限不同。表3列出了3 种酰胺醇类兽药的仪器检出限、检测条检出限和我国的限量标准。

表2　生鲜牛乳中兽药残留的Charm检测条分析结果

表3　化合物的检出限比较

3　结论

本试验首次利用Charm检测条对新疆部分地区的生鲜牛乳样品中的八大类兽药残留进行了初筛，并对其中的酰胺醇类阳性样品和随机的几份阴性样品用UPLC-MS/MS进行了确证，通过比较表明Charm检测条有以下优势：（1）结果准确，虽然检出限比UPLC-MS/MS高，但在国家限量标准范围内；（2）操作简单，无需对样品进行前处理；（3）检测所用时间短，除了酰胺醇类耗时8 min，其它仅5 min，且一次性可操作4支检测条；（4）便于携带，可以直接在牧场、奶站进行检测，而UPLC-MS/MS必须在专业实验室才能运行。但其也存在检出限高、阳性样品检出化合物不能判断等缺点。因此Charm检测条非常适用于在采样现场对大批量样品进行兽药残留初筛，然后将疑似阳性样品带回实验室进行检出确证和定量。这样将快筛法和仪器定量法联合使用，不仅能在保证样品数据量的情况下提高工作效率，还能减少样品对仪器离子源的污染，防止交叉污染造成数据的失真。

从本试验对被检生鲜牛乳样品试纸条检测结果来看，新疆部分地区生鲜牛乳中有兽药残留的情况，其中散装奶中的兽药残留种类较多，应加强奶牛兽药的用药管理和生鲜乳中兽药残留的检测，确保牛乳的质量安全。

［1］ 新疆维吾尔自治区奶业条例（2011年修正本）. 2011年9月29日新疆维吾尔自治区第十一届人民代表大会常务委员会公告第41号公布.

［2］ Grade A pasteurized milk ordinance.US Food and Drug Administration，2003.

［3］ Rapid test Kits for the detection of antibiotics and sulphonamidesin milk. Food Safety Authority of Ireland，2002

［4］ 杨盛兴，姚智深. 浅谈牛奶兽药残留控制.第四届中国奶业大会论文集，2013：382-384.［5］ 邬晨阳，韩小江. HPLC法同时测定牛奶中7种磺胺类药物和4种氟喹诺酮类兽药. 中国卫生检验杂志，2011（2）：353-355.

［6］ 高馥蝶，赵妍，邵兵，等. 超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查牛奶中的农药和兽药残留. 色谱，2012，30（6）：560-567.

［7］ 刘波静. 毛细管电泳法测定牛奶中残留的抗生素. 中华预防医学杂志，2003，37（4）：270-271.

［8］ Hillerton J E，Halley B I，Neaves P，et al. Detection of antimicrobial substances in individual cow and quarter milk samples using Delvotest microbial inhibitor tests. Journal of Dairy Science，1999，82（4）：704-711.

［9］ Strasser A，Dietrich R，Usleber E，et al. Immunochemical rapid test for multiresidue analysis of antimicrobial drugs inmilk using monoclonal antibodies and hapteng lucoseoxidase conjugates. Analytica Chimica Acta，2003，495（1-2）：11-19.

［10］ 杜宗绪. 胶体金免疫层析技术在牛奶抗生素残留检测中的应用. 山西农业科学，2013，41（7）：762-766.

［11］ National milk drug residue data base fiscal year 2015 annual report. GLH， Incorporated 958 Steamboat Lane Heathsville，2016.

［12］ 奶业创新团队技术规范，MRT/B 31-2015.乳品中抗菌药物多残留的测定超高效液相色谱-串联质谱法.

［13］ 买热木尼沙·吾甫尔，齐新林，华实. 新疆巴州地区牛乳中抗生素残留的调查与分析.草食家畜，2014（2）：63-65.

山东熊猫乳业3.6 亿元项目在济阳奠基

【本刊辑】2016年8月12日，山东熊猫乳业有限公司奠基仪式在济阳举行。该项目投资方浙江熊猫乳业集团股份有限公司为目前国内规模最大的炼乳生产企业。济阳食品产业的高度集聚，一定程度上成为当初吸引熊猫乳业“加盟”的重要砝码。

2015年，浙江熊猫乳业集团与济阳县政府达成项目合作协议，决定投资3.6 亿元建设年产3 万吨浓缩乳制品的生产加工项目。在奠基仪式上，山东熊猫乳业有限公司总经理李锡安介绍，经过济阳县和熊猫乳业方面的共同努力，山东熊猫乳业有限公司厂房总建筑面积达到66 660 平方米，其年产3 万吨浓缩乳制品生产加工项目一期工程即将破土动工。该项目将引进世界上最先进的生产设备和工艺，打造高端产品，主要产品包括全脂甜炼乳、淡奶、稀奶油、奶酪等乳制品。据熊猫乳业有关负责人透露，按照计划，山东熊猫乳业项目将于2017年8月底正式投产。项目建成后可年产各类浓缩类乳制品3 万吨，年收入达5 亿元人民币以上，创造利税2 000 万元以上。

C

越南考虑向中国出口乳制品

【本刊辑】据越“越南网”2016年7月21日报道，中越两国正讨论开放中国市场，允许越南乳制品通过官方渠道进入中国的可能性。越南的乳品制造商也纷纷采取措施，为进入中国作准备。越南工贸部部长全俊安在与中国国家质量监督检验检疫总局的对话中，希望中方加快考虑越南乳制品进入中国市场的流程。中国国家质量监督检验检疫总局的一名代表在回复中则要求越南方面提供更多所需文件。

Rapid Detection of Veterinary Drug Residues in Xinjiang Raw Milk

FAN Ying-ying1，2，3，CHEN He1，2，3，WANG Fu-lan1，2，3，LIU Sheng-hong1，2，3， MA Sha4，QI Xin-lin5*

（1 Institute of Quality Standards & Testing Technology for Agro-Products，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences；2 Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products （Urumqi）；3 Key Laboratory of Agro-products Quality and Safety of Xinjiang；4 Institute of Food Science and Medicine，Xinjiang Agricultural University；5 Xinjiang Uygur Autonomous Region Office of Dairy Industry）

The widely used of antibiotic in dairy cows caused the problem of veterinary drug residues in raw milk，which has been a serious threat to the milk quality security. This study adopted the rapid detection strips based on colloidal gold ligand-receptor recognition technology to analyze eight types of veterinary drug residue for fifty-five raw milk samples collected from dairy company，dairy cooperative and bulk milk in Xinjiang. Results showed that there were veterinary drug residues existed in Xinjiang raw milks and the amount of residue types was most in bulk milk. In addition，five raw milk samples were analyzed amide alcohols veterinary drugs via liquid chromatography-tandem mass spectrum（LC-MS/MS）for confirmation. By comparing the results of rapid detection strips method with the LC-MS/MS，it could be concluded that the rapid detection strips method was accurate，easy to operate，low cost，time-saving and portable，which was particularly suitable for preliminary screening of large amount of samples and would greatly improve the work efficiency for evaluation of veterinary drug residues in Xinjiang when combined utilization with LC-MS/MS.

raw milk；veterinary drug residues；detection strips

齐新林（1966-），学士，高级畜牧师，主要从事畜牧业生产管理和生鲜乳质量安全监管和监测。

国家农产品质量安全风险评估项目（GJFP201600802），新疆科技支疆项目计划（指令性）项目（2016E02033），新疆农业科学院青年基金项目（xjnkq-2016018），新疆农业科学院农产品质量安全重点实验室建设项目（xjnkkl-2013-003）］

2016-08-01）

范盈盈（1987-），硕士，助理研究员，主要从事农产品质量安全与风险评估研究。