普罗布考干预大鼠非酒精性脂肪肝形成的作用及机制研究

卢彩平　赵晓建　赵亚红　褚伟伟　苏白玉　任巧华



·论著·

普罗布考干预大鼠非酒精性脂肪肝形成的作用及机制研究

卢彩平赵晓建赵亚红褚伟伟苏白玉任巧华

目的探究普罗布考对大鼠非酒精性脂肪肝形成作用的干预情况及干预机制。方法选取30只SD大鼠，将其随机分为空白组、高脂组及研究组，每组10只。给予相应喂养方法，通过高脂饮食诱发实验大鼠出现NAFLD，建立模型，喂养18周后，处死全部大鼠，并进行血脂及肝功能相关指数，即TC、TG、AST、ALT及HDL与LDL水平，计算肝脏指数同时检测其肝脏组织FXR、SHP及SREBP-1c mRNA表达情况。结果3组大鼠肝脏病变程度均以高脂组最高，空白组最低，研究组脂肪性病变、炎性程度及纤维化病变评分分别为(2.97±0.18)分、(1.29±0.27)分及(0.05±0.02)分，均位于其他2组评分之间。高脂组与研究组TC、ALT、AST及LDL与空白组比较均明显升高，且高脂组升高程度更为明显(P<0.05)，空白组FXR、SHP及SREBP-1c的mRNA水平分别为(0.92±0.42)β-actin、(1.01±0.60)β-actin、(0.68±0.27)β-actin，各检测项目均显著高于高脂组(P<0.05)，研究组FXR、SHP的mRNA表达水平位于其他2组之间，分别为(0.28±0.13)β-actin及(0.42±0.23)β-actin，差异有统计学意义(P<0.05)，而SREBP-1c的mRNA表达水平为(0.68±0.22)β-actin，与空白组基本相同(P>0.05)。结论普罗布考对由高脂饮食导致的大鼠NAFLD症状具有一定的预防作用，可明显减轻由该因素导致的大鼠肝脏出现脂肪性样变情况，其预防机制为该药物提高了大鼠机体的抗氧化能力，从而降低了组织出现氧化应激而导致的损伤。

普罗布考；非酒精性脂肪肝；干预

非酒精性脂肪肝(NAFLD)主要是由于遗传、环境及生活方法等多种因素所共同导致的代谢性综合征，有研究表明，该病症的产生与胰岛素抵抗及2型糖尿病具有一定联系[1]。目前，对该病致病机制较为认同的解释为患者出现胰岛素抵抗，进而导致机体出现氧化应激和脂质过氧化反应[2]，并对肝细胞造成一定影响，并导致患者出现脂肪性肝炎。因此，对该疾病的治疗以采用抗氧化剂，增强机体抗氧化能力为主。普罗布考是一种抗氧化作用很强的制剂，研究表明，其抗氧化作用远高于尼莫地平及卡托普利等常规药物[3],其抗氧化能力分别是维生素E、尼莫地平、维拉帕米、卡托普利的5～6倍、16倍、95.5倍和104倍。研究人员通过对大鼠进行普罗布考研究，发现其对NAFLD的形成可起到一定的抑制作用。本次研究通过高脂饮食诱导非酒精性脂肪肝模型，探究普罗布考对NAFLD的预防作用及机制，报告如下。

1　材料与方法

1.1动物分组选取30只SD大鼠(由吉林大学医学部实验动物中心提供)，均为雄性，体重(208.26±10.15)g，进行5 d的适应性饲养，之后将其随机分为3组，每组10只，空白组给予普通饲料喂养；高脂组给予高脂饲料[4](配方：80%普通饲料，10%猪油，5%豆油，2%蔗糖及3%胆固醇)；研究组给予高脂饲料的同时，采用500 mg·kg-1·d-1剂量的普罗布考试剂进行灌胃处理。喂养时间18周。

1.2标本采集喂养结束后，将全部大鼠处死，并进行血清分离及肝部采样操作，将每只大鼠肝部组织分为3份：(1)于-80℃环境下保存，之后行肝脂质水平检测[5]；(2)采用浓度为15%的甲醛进行固定，并进行病理学诊断；(3)采用浓度为4%的戊二醛进行固定，并进行透射电镜对肝细胞结构进行观察。

1.3方法

1.3.1病理学检查:将肝组织进行常规包埋并进行切片处理，采用苏木精及伊红进行染色，之后，由病理学学者对其进行光镜下检查，并对肝组织脂肪样变、纤维化样变及病灶数目进行评分，分数0～5分，病变程度越高，得分越高，每张切片观察数目为9个视野。

1.3.2检测指标:检测其血脂及肝功能相关指数，即TC、TG、AST、ALT及HDL与LDL水平，对各大鼠肝脏重量进行测量，并计算肝脏指数(肝脏指数=肝脏重量/体重)，同时检测其肝脏组织FXR、SHP及SREBP-1c mRNA表达情况。

2　结果

2.13组大鼠肝脏形态特点比较空白组大鼠肝脏呈鲜红色，且边缘清晰，光镜下观察结果显示结构规整，小叶组织清晰，界板规则行高，肝索为单层结构、细胞呈多变形且较大，无明显异常；高脂组大鼠肝脏体积与其他两组相比明显增加，且呈浅黄色并伴有油腻感，肝组织边缘与空白组相比明显变钝，光镜下观察发现，肝小叶结构性差，可发现肝细胞脂肪样变程度深，并伴有一定程度的肝组织病灶样坏死及轻中度炎性症状，少数大鼠肝组织出现片状坏死并伴有程度较深的纤维性样变，中央静脉也出现一定程度的炎症现象并伴有纤维性样变；研究组大鼠肝脏颜色、大小及边缘情况介于空白组与高脂组之间，光镜下观察，仍可发现其小叶结构，且边界规则性较高，肝细胞出现一定程度的脂肪性样变及炎性反应，但程度不及高脂组，中央静脉存在轻度扩张现象并伴有轻度炎性反应。见图1～3。

图1 空白组大鼠肝脏病理(HE×100)图2 高脂组大鼠肝脏病理(HE×200)图3 研究组大鼠肝脏病理(HE×200)

2.23组大鼠肝细胞超微结构比较空白组大鼠肝细胞超微结构正常；高脂组大鼠干细胞可见数目较多的圆形或类圆形脂滴物质，细胞内线粒体、内质网等部分与正常大鼠肝细胞内线粒体存在明显差异，主要为线粒体大部分脊与膜发生融合或未能观察到脊，且外层核膜也出现融合或消失现象爱那个，粗面内质网脱颗粒现象明显，微绒毛数量显著降低，且纤维化明显；研究组大鼠肝细胞与正常结构存在明显差异，但病变程度未达到高脂组水平，细胞内可见少量脂滴，线粒体及粗面内质网病变程度较轻。见图4～6。

2.3比较3组大鼠肝脏病变程度3组大鼠肝脏病变程度比较，差异有统计学意义(P<0.05)，空白组大鼠肝脏表现正常，未出现脂肪性病变、炎症程度及纤维化病变等症状，3项对比数据中，均以高脂组最高，空白组最低，研究组脂肪性病变、炎症程度及纤维化病变评分分别为(2.97±0.18)分、(1.29±0.27)分及(0.05±0.02)分，均位于其他2组评分之间。见表1。

图4 空白大鼠肝脏超微结构(×15000)图5 高脂大鼠肝脏超微结构(×15000)图6 研究组大鼠肝脏超微结构(×15000)

表1　3组大鼠肝脏病变程度　n=10,分,

注：与空白组比较，*P<0.05；与高脂组比较，#P<0.05

2.4比较3组大鼠血脂及肝功能指数高脂组与研究组TC、ALT、AST及LDL与空白组比较均明显升高，且高脂组升高程度更为明显(P<0.05)，研究组TC、ALT、AST及LDL水平分别为(2.98±0.91)mmol/L、(79.61±18.49)U/L、(178.35±29.58)U/L及(2.04±0.49)mmol/L。研究组TG水平与另2组比较，显著提

高(P<0.05)，HDL水平则以空白组最高，其他2组数值基本相同分别为(0.84±0.18)mmol/L及(0.85±0.16)mmol/L。见表2。

2.5比较3组大鼠肝脏组织FXR、SHP及SREBP-1c mRNA表达情况空白组FXR、SHP及SREBP-1c的mRNA水平分别为(0.92±0.42)β-actin、(1.01±0.60)β-actin、(0.68±0.27)β-actin，各检测项目均显著高于高脂组(P<0.05)，研究组FXR、SHP的mRNA表达水平位于其他2组之间，分别为(0.28±0.13)β-actin及(0.42±0.23)β-actin，差异有统计学意义(P<0.05)，而SREBP-1c的mRNA表达水平为(0.68±0.22)β-actin，与空白组基本相同，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2　3组大鼠血脂及肝功能指数　±s

注：与空白组比较，*P<0.05；与研究组比较，#P<0.05

组别FXRSHPSREBP-1c空白组0.92±0.421.01±0.600.68±0.27高脂组0.16±0.12*0.13±0.11*0.82±0.42*研究组0.28±0.13*#0.42±0.23*#0.68±0.22#

注：与空白组比较，*P<0.05；与高脂组比较，#P<0.05

2.63组大鼠肝指数空白组、高脂组及研究组大鼠肝指数分别为(2.30±0.18)%，(3.51±0.42)%及(3.45±0.29)%。

3　讨论

NAFLD是目前人们患有的常见疾病，主要由遗传因素及饮食结构导致[6]，其产生机制主要由于活性氧簇(ROS)作用，研究发现，随着体内游离脂肪酸(FFA)的增加，极易导致肝细胞出现脂肪性样变，同时，机体内大量活性因子参与该过程，并导致机体产生较多的ROS，当ROS水平达到机体抗氧化能力最大水平时，过量的氧化产物将对细胞内蛋白质及核酸造成一定损伤，造成大量肝细胞死亡，同时对肝库普弗细胞造成一定刺激，导致肝细胞出现纤维化。普罗布考是一种降脂药物，常被用于治疗高胆固醇血症，而由于其具有较强的抗氧化应急作用，近年来又被广泛用于治疗动脉粥样硬化及其他心脑血管疾病。由于其降脂作用及抗氧化作用显著，因此可大幅度提升机体抗氧化能力，使机体可耐受更高水平的ROS，同时，由于三酰甘油主要由肝脏产生，且肝内三酰甘油含量过多也易导致肝脏损伤，因此普罗布考可通过提高机体抗氧化性及降低三酰甘油，起到对肝脏的保护及对肝细胞出现脂肪性样变的预防作用。

本次研究中，通过给予实验大鼠高脂饮食，诱导其出现NAFLD，并进行普罗布考干预研究。本次研究采用的高脂饮食，在相关学者提出的配比中提高玉米油及蔗糖所占比例，使其与人们常规饮食更为接近，同时增加大鼠食欲，提高实验效果[7]。

18周后，对大鼠进行处死并观察其肝脏变化，发现高脂组大鼠肝脏有明显增大且颜色变黄并伴有油腻感，肝内出现脂肪沉积现象[8]，并同时伴有一定程度的炎性反应及纤维化病变，与空白组大鼠肝脏比较存在明显不同，说明通过高脂饮食诱导大鼠形成NAFLD模型办法可行[9]，同时，自研究组进行高脂饮食的同时给予其适量的普罗布考，结果为研究组大鼠肝脏增大及脂肪性样变情况与高脂组比较进展较轻，且实验室检测结果显示，高脂组与研究组TC、ALT、AST及LDL与空白组比较均明显升高，且高脂组升高程度更为明显(P<0.05)，研究组TG水平与另2组比较，显著提高(P<0.05)，HDL水平则以空白组最高，其他2组数值基本相同。提示普罗布考对NAFLD具有一定的预防作用，可减缓NAFLD的病变速度，以达到对肝脏的保护作用[10,11]。

空白组FXR、SHP及SREBP-1c的mRNA水平分别为(0.92±0.42)β-actin、(1.01±0.60)β-actin、(0.68±0.27)β-actin，各检测项目均显著高于高脂组(P<0.05)，研究组FXR、SHP的mRNA表达水平位于其他2组之间，分别为(0.28±0.13)β-actin及(0.42±0.23)β-actin，差异有统计学意义(P<0.05)，而SREBP-1c的mRNA表达水平为(0.68±0.22)β-actin，与空白组基本相同(P>0.05)。FXR主要由胆汁激活，之后，可激活SHP，实际发生作用，SHP作为一种抑制性核受体，通过对肝X受体的抑制作用，使SREBP-1c的表达水平下降[12]。SREBP-1c是对TG的调控、脂肪酸和TCH 的合成以及调控LDL代谢相关基因表达的转录因子，尤其在肝脏发生脂肪性样变使发挥重要作用。SREBP-1c表达效果降低可抑制脂肪酸合酶的活性，最终大量减少患者体内TG含量[13]。有相关学者研究发现，药物可通过FXR-SHP-SREBP-1c通路治疗NAFLD[14]。另有研究人员指出，在给予NAFLD大鼠服用降脂药普罗布考后，与NAFLD模型组相比，普罗布考组大鼠FXR、SHP的mRNA水平及蛋白表达水平有明显上升，而SREBP-1c的mRNA表达水平及蛋白表达则出现下降现象，因此普罗布考改善NASH 大鼠肝功及肝脏脂肪变性的作用与上调胆汁酸受体FXR 的表达水平有关[15]。该试验与本次研究结果基本相符，本次研究中，SREBP-1c的mRNA表达水平与空白组基本相同，可能与本次研究中普罗布考使用量及本次研究中采用的大鼠体质有关。还有相关学者经研究表明，给予大鼠一定量的普罗布考后，与常规喂养及高脂喂养相比，普罗布考组MDA、SOD及GSH-PX水平均位于空白组及高脂组之间，且组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。说明普罗布考具有显著的抗氧化作用，通过提高机体抗氧化能力，减轻过氧化过程中对机体的影响[16]。

总之，普罗布考对由高脂饮食导致的大鼠NAFLD症状具有一定的预防作用，可明显减轻由该因素导致的大鼠肝脏出现脂肪性样变情况，其预防机制为该药物提高了大鼠机体的抗氧化能力，从而降低了组织出现氧化应激而导致的损伤。

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Study on the effects and action mechanism of probucol on the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver in rats

LUCaiping*,ZHAOXiaojian,ZHAOYahong,etal.

*DepartmentofEndocrinology,TheFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050000,China

ObjectiveTo observe the effects of probucol on the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver (NAFLD) in rats,and to explore its action mechanism. MethodsThirty SD rats were randomly divided into blank control group, high fat group and observation group, with 10 rats in each group. The rats were fed with high fat diet for 18 weeks to induce NAFLD models.Then all the rats were sacrificed,and the serum levels of blood lipid and liver function related indexes including TC, TG, AST, ALT,HDL and LDL were detected,at the same time, the expression levels of FXR and SHP and SREBP-1c mRNA were measured.ResultsAmong the 3 groups, the degree of liver lesions in high fat group was the severest,which in blank control group was the slightest.The fatty pathological changes, severity of inflammation and fibrosis lesion scores in observation group were (297±0.18) points, (1.29±0.27) points and (0.05±0.02) points,respectively,which were located between the other two groups. The serum levels of TC,ALT, AST and LDL in high fat group were significantly increased,as compared with those in blank control group and observation group, moreover, the increase degree in high fat group was more obvious (P<0.05).The expression levels of FXR, SHP and SREBP-1c mRNA in blank control group were (0.92±0.42)β-actin,(1.01±0.60)β-actin,(0.68±0.27)β-actin,respectively,which were significantly higher than those in high fat group (P<0.05). The expression levels of FXR, SHP mRNA in observation group were (0.28±0.13)β-actin and (0.42±0.23)β-actin,respectively,there were significant differences between observation group and the other two groups (P<0.05). However the expression levels of SREBP-1c mRNA in observation group were (0.68±0.22)β-actin, there were no significant differences between observation group and blank control group (P>0.05). ConclusionThe probucol has certain preventive effects on NAFLD in rats induced by high fat diet,which can obviously relieve liver fatty degeneration of rats,and the action mechanism may be correlated to the enhancement of antioxidation ability of rats to reduce the incidence rate of tissue lesion caused by oxidative stress.

probucol;non-alcoholic fatty liver; intervention

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.19.009

050011河北省石家庄市第一医院内分泌科(卢彩平、苏白玉、任巧华)，胸外科(赵晓建、褚伟伟)，肿瘤科(赵亚红)

R 575.5

A

1002-7386(2016)19-2919-04

2016-04-11)

项目来源：河北省科学技术研究与发展指导计划项目(编号：132777200)