灰枣田间愈伤组织诱导多倍体的育种方法研究

闫　超，苏彩霞，刘晓红，李海涛，安　安（河南省新郑市红枣科学研究院，河南　新郑　451100）

灰枣田间愈伤组织诱导多倍体的育种方法研究

闫超，苏彩霞，刘晓红，李海涛，安安
（河南省新郑市红枣科学研究院，河南新郑451100）

以灰枣为试材，研究不同生长调节剂、截干高度、覆盖方式、AgNO3浓度、二甲基亚砜及秋水仙素浓度对愈伤组织形成和不定芽形成的影响，获得一套适合灰枣田间诱导多倍体的育种方法。

灰枣；愈伤组织；诱变；四倍体

多倍体是指体细胞中含有3个或3个以上染色体组（Genome）的个体，是植物最重要的进化方式之一［1］。目前，田间枣树茎尖诱变和组培条件下胚性细胞诱变均已取得明显进展。但茎尖诱变后，多获得嵌合体，分离纯化所需周期长；组培条件下通过胚状体途径虽可快速获得纯合多倍体，但仍存在从组培苗炼苗下地到开花结果周期长的问题［2-5］。因此，在田间诱导胚性愈伤组织获得纯合多倍体是一项更为理想的技术方法，不仅可以快速诱导获得纯合多倍体，而且加倍不定芽当年可发育形成木质化枝条，用于嫁接扩繁，可大大缩短多倍体育种周期，同时可彻底解决嵌合体纯化难题［6］。

枣树多倍体与二倍体相比具有更高水平的杂合性，常带来一些形态和生理上的变化，在增大果个、提高生长速度、增进遗传品质以及提高目的代谢物含量等方面具有优势。因此，灰枣多倍体育种能够增加新品种的数量，大大提高枣品种的质量，对解决目前新郑红枣普遍出现果个小、色泽差、含糖量和其它营养成分下降等问题，满足生产者和消费者需求具有重要意义。

1　材料与方法

1.1试验材料

大田所用试验材料为优良鲜食制干兼用枣品种灰枣（新郑市红枣科学研究院试验园）。

1.2试验方法

采用枝干短截的方法，把灰枣树处理成树桩，每棵树短截的枝干数以5～7个枝为佳，同时留取1 ～2个辅养枝，去除其余细小枝条。用脱脂棉绕截面形成层覆盖1圈，将诱导愈伤的药液滴加在脱脂棉上，以浸湿脱脂棉为佳，覆盖处理。

1.2.1不同生长调节剂对形成愈伤的影响

处理灰枣树枝干，滴加7个处理药液 （清水、2，4-D、ZT、TDZ、NAA、TDZ与TBA、ZT与NAA），将脱脂棉充分浸湿，每个处理25个枝，覆盖泥和黑色塑料袋，15 d后观察愈伤形成。

1.2.2截干的不同高度对形成愈伤的影响

处理灰枣树枝干，截留距离地面1 m以上和1 m以下2种高度枝干，用脱脂棉绕截面形成层覆盖一圈，用滴管将TDZ 4.0 mg/L+AgNO32.0 mg/L药液滴于脱脂棉上，以浸湿脱脂棉为宜。然后用塑料袋+ 泥+塑料袋覆盖截面，每个处理10个枝，观察枝干截面愈伤形成情况。

1.2.3不同覆盖方式对形成愈伤的影响

处理灰枣树枝干，用TDZ 4.0 mg/L+AgNO32.0 mg/L药液浸湿形成层上铺设的脱脂棉，然后采用“塑料袋+泥+塑料袋”、“泥+塑料袋”和“黑塑料袋”3种覆盖方式，每种覆盖方式10个枝干，观察枝干截面愈伤形成情况。

1.2.4不同浓度AgNO3对形成愈伤的影响

处理灰枣树枝干，用浓度为1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L AgNO3溶液分别滴于脱脂棉上，每个处理5个枝，用塑料袋+泥+塑料袋覆盖截面，观察枝干截面愈伤形成情况。

1.2.5二甲基亚砜对形成愈伤的影响

在0.05％秋水仙素+TDZ 4.0 mg/L+AgNO32.0 mg/L药液中添加二甲基亚砜，浓度配为2％，把含有2％二甲基亚砜（DMSO）的混合药液处理灰枣树枝干截面；另外做不加二甲基亚砜的对照处理（其他成分同上），塑料袋+泥+塑料袋覆盖，观察枝干愈伤形成情况。

1.2.6不同浓度秋水仙素对形成愈伤及不定芽发生的影响

处理灰枣树枝干，把含有秋水仙素（0、0.010％、0.025％、0.050％、0.075％）+TDZ 4.0 mg/L+AgNO32.0 mg/L的药液滴加于枝干截面形成层铺设的脱脂棉上，处理时间为1 d（第2天去掉脱脂棉），同时做1个完全清水的处理，观察记录每个处理枝干截面愈伤形成及不定芽发生情况。

2　结果与分析

2.1不同生长调节剂对形成愈伤的影响

表1　不同生长调节剂对愈伤形成的影响

由表1可知，生长调节剂不同，灰枣枝干愈伤发生情况也不同。TDZ出愈率最高，达到了72％。

2.2截干高度对愈伤形成的影响

表2　截干高度对愈伤形成的影响

由表2可知，截干高度不同，其截面愈伤发生情况显著不同。灰枣1 m以上枝干截面比低于1 m枝干截面易于发生愈伤，出愈率差距达到了50％。同一品种高枝干截面出愈率高于低枝干截面，这可能与顶端优势有关。

2.3不同覆盖方式对形成愈伤的影响

表3　覆盖方式对愈伤形成和出芽的影响

由表3可知，塑料袋+泥+塑料袋覆盖后枝干截面愈伤出愈率最高，达100％，而且愈伤发生快，第5天就有透明愈伤形成，是最优化的覆盖方式；泥+塑料袋覆盖后枝干截面易霉变，黑塑料袋覆盖后枝干截面高温高湿对愈伤的生长不利。因此，以塑料袋+泥+塑料袋覆盖为宜。

2.4不同浓度AgNO3对形成愈伤的影响

表4　不同浓度AgNO3对形成愈伤的影响

由表4可知，2.0 mg/L AgNO3的出愈率最高，达到100％，显著高于其他3个浓度。

2.5二甲基亚砜对形成愈伤的影响

表5　二甲基亚砜对形成愈伤的影响

由表5可知，添加2％的二甲基亚砜（DMSO）与否对灰枣枝干截面出愈率影响不明显。但田间观察发现其导致枝干截面愈伤形成时间推迟，70％的枝干截面到第10天才出现愈伤，愈伤生长不同步，长势差。而不加二甲基亚砜处理后，90％的枝干截面出愈伤时间会提前3 d，愈伤生长整齐。2％二甲基亚砜与秋水仙素配合使用延迟了愈伤组织的形成，分析二甲基亚砜的使用可能导致了枣树枝干截面组织细胞的生理损伤。因此，在实践中应适当降低二甲基亚砜的使用浓度，在考虑其增加药剂渗透效果的同时，还要想到是否对试验材料有损伤、是否会影响到试验材料的生长发育等因素。

2.6不同浓度秋水仙素对形成愈伤及不定芽发生的影响

由表6可知，不同浓度秋水仙素+4.0 mg/L TDZ+2.0 mg/L AgNO3的出愈率没有受到秋水仙素的抑制影响。如不同浓度秋水仙素处理枝干截面后其出愈率均超过了无秋水仙素的TDZ 4.0 mg/L+ AgNO32.0 mg/L处理，高达95％。随着秋水仙素浓度的增加，出愈率并没有降低。分析可能是由于秋水仙素浓度偏低的原因，也表现出了田间枣树枝干截面愈伤组织对秋水仙素有一定的忍耐能力。

从秋水仙素处理后的出芽率来看，灰枣在0.025％秋水仙素时出现最小值，与最大值50％差异水平显著。TDZ 4.0 mg/L+AgNO32.0 mg/L处理与水处理比较，出芽率无显著差异。在添加秋水仙素后，不定芽的发生受到抑制，表现为随着秋水仙素浓度的增加（0.010％～0.075％），出现高-低-高-低的变化趋势，秋水仙素浓度为0.05％时，出芽率最高。

3　小结

通过对愈伤组织发生影响因子的分析，获得变异芽的最佳方法为：对灰枣树枝干进行短截后，先滴加TDZ 4.0 mg/L+AgNO32.0 mg/L于形成层的脱脂棉上，塑料袋+泥+塑料袋覆盖处理。诱导愈伤组织5～6 d后，枝干截面泛红褐色，形成层开裂，有透明微弱愈伤出现时，去除塑料袋、泥、脱脂棉等覆盖物，露出愈伤组织，用脱脂棉覆盖愈伤组织，把6～10滴浓度为0.05％的秋水仙素 （含有1％二甲基亚砜）滴加到脱脂棉上。迅速覆上塑料袋，将和好的湿泥覆盖在塑料袋上，最外面再用塑料袋全部套住，用塑料绳收紧袋口。24 h后，去除脱脂棉，用湿泥直接覆盖愈伤组织再用塑料袋套住，用塑料绳收紧袋口。5～7 d后，检查愈伤组织的生长情况，正常的愈伤组织生长量增加，多呈黄白色。对生长欠佳的愈伤组织（愈伤组织呈红褐色，生长量小），可用TDZ 4.0 mg/L、AgNO3 2.0 mg/L药液进行二次诱导处理，再次用塑料袋+湿泥+塑料袋覆盖。15～20 d后会有大量芽点出现，当芽长到1～2 cm时，去除所有覆盖物。

［1］H，杜比宁.植物育种的遗传学原理［M］.北京：科学出版社，1974.

［2］刘璐璐，柴明良.秋水仙素在果树多倍体育种中的研究进展［J］.北方园艺，2006（6）：48-49.

［3］石荫坪.枣胚乳三倍体的育成及生物学细胞学研究［J］.山东果树，1985（1）：1-3.

［4］王娜，刘孟军，代丽，等.秋水仙素离体诱导冬枣和酸枣四倍体［J］.园艺学报，2005，32（6）：1008-1012.

［5］蒋洪恩，刘孟军.秋水仙碱诱导枣多倍体的研究［J］.园艺学报，2004，31（5）：647-650.

［6］宁强.枣愈伤组织诱导及多倍体诱变研究［D］.保定：河北农业大学，2003.

2016—06—21