高效液相色谱-串联质谱法同时测定水中18种酚类污染物

罗碧容，钱　蜀，潘乐丹，熊　杰，赵云芝

(四川省环境监测总站，四川　成都　610091)



高效液相色谱-串联质谱法同时测定水中18种酚类污染物

罗碧容*，钱蜀，潘乐丹，熊杰，赵云芝

(四川省环境监测总站，四川成都610091)

建立了一种同时测定地表水、地下水环境样品中18种酚类污染物的分析方法。样品经0.22 μm聚四氟乙烯滤膜过滤后，采用Thermo Hypersil ODS柱(100 mm×2.1 mm，5.0 μm)分离，以甲醇-0.01 mol/L甲酸铵/甲酸水溶液(pH 4.0)为流动相，柱温30 ℃，流速0.2 mL/min进行梯度洗脱，电喷雾负离子模式(ESI-)电离、多反应监测模式(MRM)进行检测，外标法定量。18种酚类化合物的浓度与其峰面积在一定浓度范围内均呈良好线性关系(r2≥0.999 1)，方法检出限为0.02～0.51 μg/L。18种酚类化合物在低、中、高浓度的平均加标回收率为84.5%～112%，相对标准偏差(n=6)为0.6%～4.3%。此方法灵敏度高、干扰小、分析速度快，适用于地表水、地下水等较洁净水环境样品中18种酚类污染物的同时分析。

高效液相色谱-串联质谱法;酚类污染物;地表水;地下水;直接进样

随着工农业的发展，酚类化合物被广泛用于染料、医药、杀菌剂、防腐剂、除草剂、炸药及有机合成等方面，含有酚类污染物的废水大量排放造成水体及土壤中的污染物残留，并且很难降解，给细菌、微生物、植物及动物造成一定的毒害作用。据化学物质毒性数据库(RTECS，Registry of Toxic Effects of Chemical Substances)的标准，2,4-二氯酚与2,4,6-三氯酚为致癌物，五氯酚为可疑致肿瘤物，很多酚类物质对生物的DNA、生殖、血液、神经等系统均有一定的毒害作用[1]。各国纷纷制定了酚类污染物的相关法规及标准[1]。其中2-氯酚、2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、五氯酚、4-硝基酚、2,4-二硝基酚、4-氯-间甲酚、4,6-二硝基-2-甲酚被列入美国EPA水环境中优先控制污染物黑名单;2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、五氯酚、4-硝基酚被列入中国水中优先控制污染物黑名单[2]。

目前水中酚类化合物的分析方法主要有高效液相色谱法[3-7]、高效液相色谱-质谱法[8-11]、气相色谱法[12]、气相色谱-质谱法[13-16]、离子色谱法[17]、离子色谱-质谱法[18]等。而用于水中酚类化合物测定的前处理方法主要有固相萃取法[3,9,18]、液液微萃取法[4-5]、液液微萃取-衍生法[6]、分子印迹-固相微萃取法[7]、离子液体萃取法[8]、衍生-直接进样法[10]、微孔滤膜过滤-直接进样法[11]、衍生-液液萃取法[12]、固相微萃取法[13-14]、液液萃取法[15]、固相膜萃取法[16]等;其中液液萃取法通常需氯苯、二氯甲烷、正己烷等有机试剂，且用量较大，造成二次污染问题;固相萃取法有机溶剂用量少，自动化程度高，但实验步骤多，且成本较高;固相微萃取回收率高、设备简单，但成本高、萃取涂层易磨损、使用寿命短;微孔滤膜过滤-直接进样法与其他前处理方法比较，具有操作简单、实验步骤少、成本低、最大程度保持了样品的真实性、引起随机误差的可能性小等特点。

本文分析的18种酚类化合物包括硝基酚类、氯酚类、萘酚类等，其化学性质有差异，目前未见同时对其分析的相关文献报道。为了简化环境监测分析方法，提高工作效率与方法灵敏度，提高环境应急监测能力及速度，本方法通过优化液相色谱与质谱条件，建立了直接进样/高效液相色谱-串联质谱法同时并快速测定水中18种酚类污染物的分析方法，无需萃取、浓缩等前处理步骤，干扰小，最大程度反映出样品的真实性与代表性，方法操作简单、快速，灵敏度高。

1　实验部分

1.1仪器、材料及试剂

API4000QTrap 三重四极杆质谱仪(美国AB Sciex公司);高效液相色谱仪(日本岛津公司);Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司);Thermo Hypersil ODS 色谱柱(100 mm×2.1 mm×5 μm，美国Thermo公司);0.22 μm聚四氟乙烯滤膜(津隆公司);玻璃针筒。

甲醇(HPLC级，J&K Scientific Ltd.);甲酸(HPLC级，CNW Technologies);甲酸铵(HPLC级，Fluka 公司);1 000 mg/L的4-硝基酚、3-硝基酚、4-氯酚、3-氯酚标准溶液及5 000 mg/L的2,4,6-三氯酚标准溶液(美国AccuStandard公司)，2 000 mg/L的2,4,6-三溴酚标准溶液(美国Supelco公司)，100 mg/L的2,4,6-三硝基酚、4,6-二硝基-2-甲酚、2-环己基-4,6-二硝基酚、3-甲基-4-硝基酚、2,4-二硝基酚、2,6-二硝基酚、2,4,6-三硝基-间-苯二酚、4-氯间甲酚、2,4-二氯酚、五氯酚、2-萘酚、1-萘酚标准溶液(美国AccuStandard公司)，各标准溶液均以甲醇为溶剂，置于-18 ℃避光保存。实验用水为超纯水。

18种混合标准溶液：分别吸取一定量的上述标准溶液，以甲醇稀释配成浓度为0.50～20 mg/L的混合标准溶液，标准使用液以超纯水稀释18种混合标准溶液获得，现用现配。

1.2样品采集与前处理

按照HJ/T 91，GB/T 14581，HJ/T 164和HJ/T 493的相关规定，用预先洗涤干净并烘干的磨口棕色玻璃瓶采集水样，满瓶采集。样品运输过程应防震、低温保存、避免阳光照射，防止运输车内被污染。采集的样品应尽快分析。

用玻璃针筒抽取水样溶液并过0.22 μm聚四氟乙烯滤膜后，直接进样分析。

1.3色谱-质谱分析条件

色谱柱：Thermo Hypersil ODS柱(5 μm，100 mm×2.1 mm i.d.);流动相：A为甲醇溶液，B为0.01 mol/L甲酸铵-甲酸水溶液(pH 4.0);流速0.2 mL/min;柱温30 ℃;进样量10 μL;梯度洗脱程序：0.01～10.00 min，30%～90%A;10.00～12.00 min，90%～95%A;12.01～16.00 min，30%A。

质谱采用电喷雾负离子模式(ESI-)电离，多反应监测模式(MRM)检测。质谱离子化参数：喷雾电压-4 500 V，气帘气(压力1.38×105Pa)、雾化气(压力4.48×105Pa)、辅助气(压力4.83×105Pa)为高纯氮气，辅助气温度650 ℃，碰撞气设置Medium。18种酚类污染物的质谱条件见表1。

表1　18种酚类污染物的质谱条件Table 1　ESI MS/MS conditions of 18 phenols pollutants

* quantitative ion

2　结果与讨论

2.1滤膜的选择

考察不同材质的滤膜对目标化合物回收率的影响。用水配制一定浓度的空白加标样品，分别经孔径0.22 μm的聚醚砜、尼龙66、醋酸纤维、聚四氟乙烯滤膜过滤后，进行HPLC-MS/MS分析。发现尼龙66滤膜对4-氯苯酚、3-氯苯酚、4-硝基酚、3-硝基酚的影响较小，对其他化合物的影响很大，有些化合物的回收率非常低;聚醚砜滤膜对2-环己基-4,6-二硝基酚、五氯酚、萘酚的影响很明显，尤其2-环己基-4,6-二硝基酚的回收率很低;表明聚醚砜和尼龙66材质的滤膜对多种酚类化合物具有不同程度的吸附作用。醋酸纤维与聚四氟乙烯滤膜对18种化合物的影响均较小，但两者相比，2,4-二硝基酚、3-硝基酚、萘酚、2,4-二氯酚经聚四氟乙烯滤膜处理后的回收率略高，所以本实验选用0.22 μm聚四氟乙烯滤膜。

2.2标准溶液配制溶剂的选择

分析环境样品时，是以水层溶液直接进样，而化合物标准溶液以甲醇或乙腈为溶剂，因而考察了10%，20%，40%，60%的甲醇或乙腈溶剂含量对目标化合物保留行为的影响。结果发现，有机溶剂含量对目标化合物的响应值影响不明显，但对有些化合物的峰形影响很大。当甲醇含量大于20%或乙腈含量大于10%时，3-氯酚、4-氯酚、2,4,6-三硝基-间-苯二酚、4-硝基酚、2,4-二硝基酚及2,6-二硝基酚均出现不同程度的峰展宽、拖尾，甚至裂峰、同分异构体峰重叠;使用超纯水作溶剂时，除2,4,6-三硝基-间-苯二酚外，其他化合物的峰形均对称且尖锐，且同分异构体均可完全分离。为避免溶剂效应的影响，考虑到分析样品均为水溶液，故实验选择超纯水为溶剂并确保加标或曲线浓度点标液中的甲醇含量小于20%或乙腈含量小于10%。

2.3液相色谱条件优化

2.3.1色谱柱的选择酚类化合物的水溶性较强，属弱酸类物质;本文中18种酚类化合物的性质存在一定差异，应用不同的色谱柱，响应值与分离情况有一定的差距。分别比较了Discovery C18(100 mm×2.1 mm，5 μm)，Kromasil 100-5 C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)，Shim-pack XR-ODS(75 mm×2.0 mm，2.2 μm)和Thermo Hypersil ODS(100 mm×2.1 mm，5 μm)4种色谱柱的分离效果。结果发现，在Discovery C18和Kromasil 100-5 C18柱上，4-氯酚与3-氯酚、2-萘酚与1-萘酚的分离度不理想;与Thermo Hypersil ODS柱相比，Shim-pack XR-ODS柱上2,4,6-三硝基-间-苯二酚的峰展宽更明显，3-甲基-4-硝基酚的基线很高，测定高浓度样品时峰展宽明显，且2,4,6-三硝基酚与4-硝基酚、2,4,6-三溴酚与2-环己基-4,6-二硝基酚不能有效分开;而在Thermo Hypersil ODS柱上，除2,4,6-三硝基-间-苯二酚峰展宽较明显外，各化合物的响应值均较高，分离度比较理想。因而，本实验选择Thermo Hypersil ODS(100 mm×2.1 mm，5 μm)色谱柱对待测物进行分离。

2.3.2流动相的选择以Thermo Hypersil ODS为分析柱，比较了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-甲酸铵水溶液(0.005，0.01，0.02 mol/L)等流动相对目标化合物保留行为的影响。结果表明，用甲醇作为流动相时，目标化合物的分离度较好、响应值较高;当向水相中添加甲酸铵后，溴、氯代酚类化合物的响应值反而降低，但带硝基的酚类化合物峰形有明显改善，峰展宽减小，峰形变得更加尖锐而对称，分离度也有改善，并且随着甲酸铵浓度的提高，目标响应值明显升高，甲酸铵浓度为0.01 mol/L时趋于平稳，浓度再增大，目标响应值反而降低，可见缓冲盐浓度太高反而抑制化合物的电离效率。因而实验选择甲醇-0.01 mol/L甲酸铵水溶液为流动相。

同时比较了流动相pH值(3.0，4.0，5.0)对目标化合物保留行为的影响，结果表明，pH 4.0时目标化合物的响应值均达最大，并且4对同分异构体均可完全分离。故实验选择pH 4.0的甲酸铵-甲酸水溶液作为流动相水相。

2.4质谱条件优化

用甲醇溶液分别配制浓度为1.0 mg/L的18种酚类化合物的单标溶液，以注射泵方式连接，流速10 μL/min，对每个化合物进行质谱参数优化，确定其母离子与子离子、去簇电压、入口电压、碰撞池出口电压、碰撞能量。在二级质谱扫描过程中发现，2-萘酚只有1个高响应碎片，其他碎片的相对丰度非常小，参考《水质 苯氧羧酸类除草剂的测定 液相色谱/串联质谱法》(征求意见稿)，采用同位素离子与其二级碎片离子作为定性离子对，具体参数见表1。

以优化的色谱条件与质谱参数，建立液相色谱-质谱联用方法，不接样品分析柱，用20 μg/L标准溶液对质谱离子化参数进行自动优化，包括喷雾电压、雾化气、辅助气、辅助气温度、气帘气。最佳质谱条件如“1.3”所示。

在优化的色谱与质谱条件下，18种酚类化合物标准溶液的总离子流图见图1。

2.5标准曲线

浓度为0.50～20 mg/L(2,4,6-三硝基-间-苯二酚、2,4,6-三硝基酚、2,4-二硝基酚、3-甲基-4-硝基酚、2-环己基-4,6-二硝基酚均为0.50 mg/L;2,6-二硝基酚、4-硝基酚、3-硝基酚、4,6-二硝基-2-甲酚均为1.5 mg/L;2-萘酚、1-萘酚、2,4,6-三溴酚均为10 mg/L;4-氯酚、3-氯酚、4-氯间甲酚、2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚均为20 mg/L;五氯酚为5.0 mg/L)的混合标准溶液以超纯水进行不同倍数稀释，在优化条件下进行分析，以化合物的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。18种酚类污染物在一定浓度范围内均具有良好的线性关系，相关系数均不小于0.999 1(表2)。

2.6精密度与检出限

根据《环境监测 分析方法标准制修订技术导则》(HJ168-2010)中的检出限试验方法，针对多组分分析方法，大于50%被分析物样品加标浓度在检出限2～5 倍范围内，大于90%被分析物样品加标浓度在检出限1～10 倍范围内，进行7次平行测定，计算检出限LOD=3.143S(S为标准偏差)，18种酚类化合物的检出限在0.02～0.51 μg/L范围内，均明显低于现有环境水质标准的限值[19-23](表2)。分别对低、中、高3个浓度水平的加标样品进行6次平行测定，根据峰面积与标准曲线计算浓度值及相对标准偏差(RSD)，18种酚类污染物的RSD在0.6%～4.3%范围内(表2)。

表2　18种酚类污染物的线性范围、相关系数、检出限及精密度Table 2　Linear ranges，correlation coefficients(r2)，limits of detection(LODs) and precisions(RSDs) of 18 phenols pollutants

-：the phenol has no standard limit;/：the concentration of experimental precision is different

2.7实际样品分析与方法准确度

采集某地表水和地下水，分别经0.22 μm聚四氟乙烯滤膜过滤，进样分析，测得地表水中的2,4-二硝基酚、4-硝基酚、3-硝基酚、3-甲基-4-硝基酚、4,6-二硝基-2-甲酚背景浓度分别为0.64，1.6，0.22，0.13，0.31 μg/L，其他酚类污染物均未检出;而地下水中均未检出本文18种酚类污染物。采用实际样品加标并过膜测定回收率的方法来考察方法准确度，加标浓度分别为0.50，5.0，20 μg/L或分别为5.0，20，200 μg/L，每个样品平行测定3次，18种酚类污染物的加标平均回收率为84.5%～112%(表3)。

表3　样品的测定结果及加标回收率Table 3　Determination results and recoveries of environmental samples

3　结　论

本文建立了滤膜过滤、直接进样/高效液相色谱-串联质谱同时测定水中18种酚类污染物的分析方法。该方法灵敏度高、分析速度快、操作简便、结果准确可靠，样品在16 min内完成分析，方法检出限为0.02～ 0.51 μg/L，明显低于现有环境水质标准[19-23]限值(9～500 μg/L);18种化合物的相对标准偏差均小于5.0%，地表水与地下水样品的加标平均回收率为84.5%～112%，满足环境监测质量控制要求。方法可应用于较洁净的地表水、地下水及环境应急监测中酚类污染物的快速分析，而针对悬浮物较多、基质较复杂的环境水样可增加净化前处理步骤，然后进行分析检测。

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Simultaneous Determination of 18 Phenols Pollutants in Water Samples by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LUO Bi-rong*，QIAN Shu，PAN Le-dan，XIONG Jie，ZHAO Yun-zhi

(Sichuan Environmental Monitoring Center，Chengdu610091，China)

A method was developed for the simultaneous determination of 18 phenols pollutants in water samples by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS) combined with direct injection.The water samples were filtered through 0.22 μm of polytetrafluoroethylene(PTFE) microfiltration membrane.With methanol-0.01 mol/L ammonium formate/ formic acid aqueous solution (pH 4.0) as mobile phase，the separation was performed on a Thermo Hypersil ODS column(100 mm×2.1 mm，5.0 μm) by gradient elution.The flow rate was 0.2 mL/min.The column temperature was 30 ℃.Samples were detected in multiple reaction monitoring (MRM) mode with negative electric spray ionization.The phenols pollutants were quantified by the external standard method.The calibration curves of the phenols pollutants showed good linearities in a certin concentration range with correlation coefficients(r2) not less than 0.999 1，the detection limits of phenols pollutants ranged from 0.02 μg/L to 0.51 μg/L.The relative standard deviations(RSD，n=6) of 18 phenols pollutants were in the range of 0.6%-4.3%.The spiked recoveries of 18 phenols pollutants at low,medium and high levels ranged from 84.5% to 112%.The method was sensitive，rapid and little interference.It is suitable for the simultaneous determination of 18 phenols pollutants in relatively clean water samples，such as groundwater and surface water.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS);phenols pollutants;surface water;groundwater;direct injection

2016-01-11；

2016-03-10

国家环境保护标准制定项目(2014-35)

罗碧容，硕士，工程师，研究方向：环境样品中残留的痕量有机物分析，Tel：028-61501155，E-mail:lbr2001@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.008

O657.63;O625.31

A

1004-4957(2016)08-0974-07