RP/SCX双模式混合机理固定相评价研究

于慧雯，马晓茹，郑书源，徐基伟，，李彤，夏明珠，王风云*

（1. 南京理工大学，江苏 南京 210094；2. 大连依利特分析仪器有限公司，辽宁 大连 116023）

RP/SCX双模式混合机理固定相评价研究

于慧雯1，马晓茹1，郑书源1，徐基伟1，2，李彤2，夏明珠1，王风云1*

（1. 南京理工大学，江苏 南京 210094；2. 大连依利特分析仪器有限公司，辽宁 大连 116023）

液相色谱多模式混合固定相同时具有多种分离机理，被越来越多的应用于复杂样品的分析。通过改变两种改性基团的投料比，制备了一组经典的RP/SCX双模式混合固定相，并对其进行了系统的评价研究。采用元素分析、离子交换当量测试，得到了-C18与-SO3H两种基团的比例，验证了空间位阻对-C18键合率的影响；分别在反相和离子交换模式下，考察了疏水性样品、离子样品的保留行为；并成功分离了含有6种不同类型化合物的混合物。评价结果表明，制备的固定相同时具有反相和离子交换色谱的双重保留机理，为此类固定相分离复杂样品提供了参考数据。

双模式混合固定相；反相色谱；阳离子交换色谱；评价研究

前言

反相色谱是目前应用最为广泛的一种液相色谱分离模式，但在分离强极性及离子样品时，往往不能表现出良好的分离选择性，在此类应用中存在局限性［1］。混合模式色谱固定相具有多重保留机理，对复杂样品分离有一定优势，成为近年来的研究热点［2，3］。彭西甜等［4］制备了辛基-磺酸基共同键合的反相强阳离子交换混合色谱固定相，并使用几种碱性样品作为探针研究了混合色谱固定相的两点保留模型。梁鑫淼等［5］利用一种HILIC/WCX复合模式固定相，分别在HILIC、WCX和HILIC/WCX模式下，系统研究了壳寡糖的分离行为，并在HILIC/WCX模式下获得更好的峰形。杨炳成等［6］采用制备的Click-ASP固定相，在HILIC模式下分离核苷和核酸混合物，在离子色谱模式下分离了无机阴离子。混合模式固定相中最为常见的是具有正交性质的RP/IEC固定相［7，8］，兼具反相和离子交换的双重保留机理，可以很好的解决反相色谱对强极性和离子样品保留较弱的问题，应用于多肽和蛋白质分离［9-11］、药物分子检测［12，13］、中草药提纯［14］等领域。

在我们的前期工作中，制备了一种C18-磺酸基双模式复合固定性，并进行了初步的探讨。本文在此基础上，对固定相的制备方法及不同模式下的色谱性能进行了评价研究。

1　实验部分

1.1仪器、试剂与材料

仪器：P1201高效液相色谱仪，包括UV1201紫外-可见检测器、P1202高压恒流泵，大连依利特分析仪器有限公司；7725i手动进样阀（10μL进样环），美国Rheodyne公司；Vario EL型有机元素分析仪，德国Elementar；超声波清洗仪（AS20500AT），天津奥特赛恩斯仪器有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵，天津市津腾实验设备有限公司。

试剂：5 μm球形硅胶（ThermoFisher Scientific，169 m2/ g，120），十八烷基三氯硅烷（95%）、3-巯丙基三甲氧基硅烷（97%）、苄胺、苯胺、三聚氰胺（北京百灵威科技有限公司）；甲苯、乙苯、丙苯、丁苯、戊苯、浓硫酸（98%）、磷酸二氢钠（天津科密欧试剂有限公司）；甲醇、乙腈，色谱纯（美国TEDIA天地试剂公司）；Milli-Q超纯水。

1.2实验条件

1.2.1固定相的制备

将硅胶在浓硫酸条件下活化得到活化硅胶（activated silica，简称AS），将不同比例的十八烷基三氯硅烷（Octadecyltrichlorosilane，简称OTS）和3-巯丙基三甲氧基硅烷（trimethoxysilylpropanethiol，简称MPS）键合到硅胶表面，得到C18-巯基键合硅胶（octadecyl-mercapto silica，简称OMS）；将OMS进一步氧化得到目标产物C18-磺酸基固定相（octadecylsulfonic silica，简称OSS）。

1.2.2色谱柱的装填

采用高压等密度匀浆技术，将制备的固定相装填为ID 4.6 mm ×150 mm色谱柱进行后续评价。

1.2.3离子交换当量测试

流动相A：乙腈:10mmol/L的磷酸二氢钠缓冲液（pH=3.0）=20:80（V/V），流动相B：含有浓度为0.5 mg/mL三聚氰胺样品的流动A。流速1 mL/min，采用流动相A对系统进行平衡30 min后，切换到流动相B并同时用工作站254 nm波长采集信号，记录曲线的突跃时间T。

色谱柱离子交换当量计算公式为：Q=CF（Tb-T0），其中Q为离子交换当量，C（mg/mL）为三聚氰胺的浓度，F（mL/min）为实验过程中的流速，Tb（min）为系统连接混合色谱柱时的突跃时间，T0（min）为系统未连接色谱柱时的突跃时间。

2　结果与讨论

2.1元素分析和离子交换当量测试结果

对制备的混合色谱固定相进行元素分析，并根据分析结果测算了C18与磺酸基的摩尔比，具体结果如表1所示。参考文献［12］报道的方法，采用三聚氰胺，进一步测定制备的3种固定相的离子交换当量，具体实验步骤见1.2.3。计算得到三根混合色谱柱的离子交换当量依次为1105 μg/g、739 μg/g、470 μg/g。

表1　混合固定相信息参数表Table 1 Information table of OSS

结合元素分析与离子当量的测定结果可知，3种固定相中两种官能团的比例与投料变化趋势基本一致，随着OTS投料比例增加，固定相中的C元素含量不断增加，S元素含量不断减少，换算出的C18含量也逐渐增加，磺酸基减少。制备固定相过程中，C18链相对较长，在同时键合时空间位阻更大，所以与理论投料量相比，C18的键合量相对较少。

2.2疏水样品的分离行为评价

采用丁苯作为分析对象，在反相分析模式下，考察其在3支混合模式色谱柱上的保留情况，结果如1（a）所示，随着混合柱C18含量的增大，丁苯的保留时间增加。继续在反相模式下，选择固定相为OOS-2的混合柱，甲苯和乙苯为分析对象，考察流动中甲醇比例变化，对样品保留行为的影响，结果如图1（b）所示，并考察了流动相中甲醇含量对样品洗脱的影响。结果如图1（b）所示，随着流动相中甲醇比例的提高，洗脱强度增大，样品的保留时间逐渐减小。两个实验结果都说明，RP/SCX固定相表现出良好的反相分离机理。

图1　（a）丁苯保留时间随C18基团含量变化的趋势图。色谱条件：流动相，MeOH/ H2O=85/15；流量，0.9 mL/min；检测波长，254 nm。（b）甲苯、乙苯的保留时间随甲醇含量变化的趋势图。色谱条件：流动相，甲醇水溶液；流量，0.9 mL/min；检测波长254 nm。Fig. 1（a）Dependency of retention times of butylbenzene on C18 group content. Conditions: mobile phase，MeOH/H2O=85/15； flow rate，0.9 mL/min； 254 nm.（b）Dependency of retention times of toluene and ethylbenzene on MeOH content. Conditions: mobile phase，MeOH/H2O； flow rate，0.9 mL/min； 254 nm.

2.3离子样品的分离行为评价

以苯胺为分析样品，考察流动相中盐浓度对其保留时间的影响。结果如图2（a）所示，随着流动相中盐浓度的增加，离子强度增加，苯胺的保留时间逐渐减小，表现出典型的离子交换保留机理。再以苄胺、苯胺为样品，考察了流动相pH值对其保留行为的影响。结果如图2（b）所示，由于苄胺pKa=9.34是一种强碱性物质，在pH 4.0-6.0变化范围内均以离子形式存在，故保留时间受流动相pH影响不大。苯胺的pKa=4.6，随着pH的增大，苯胺的保留时间逐渐减小，在高pH时苯胺只受到疏水保留作用；在低pH值时，苯胺以离子形式存在，受疏水和静电吸引双重保留机理作用［15］，保留时间更长。

图2　（a）盐浓度对苯胺在混合色谱柱上保留时间的影响。色谱条件：流动相，乙腈/一定浓度的醋酸盐=25/75；流量，0.9 mL/min；检测波长，254 nm。（b）苯胺和苄胺在混合柱上保留时间随流动相中pH变化趋势图。色谱条件：流动相，乙腈/20mM醋酸盐=25/75；流量，0.9 mL/ min；检测波长，254 nm。Fig.2（a）Influence of buffer concentration on the retention times of anilin on the mixed-mode column. Conditions: mobile phase，ACN/acetate=25/75； flow rate，0.9mL/min； 254nm.（b）Dependency of retention times of anilin and benzylamine on pH. Conditions: mobile phase，ACN/20mM acetate=25/75； flow rate，0.9mL/min； 254nm.

2.4混合样品分离评价

选取6种不同类型化合物作为分析对象，考察OSS-1混合柱对6种样品混合物的分离能力。结果如图3，混合柱很好的分离了这6种物质，峰形良好，说明了RP/SCX混合机理固定相具有分离复杂样品的潜在能力。

图3　6种化合物在混合柱上分离色谱图梯度条件：70～30～70A%（0～7～10 min），流动相A：20 mmol/L醋酸铵pH 4.5；流动相B：乙腈。1-对甲基苯磺酸；2-对羟基苯甲酸；3-苄胺；4-甲苯；5-乙苯；6-对苯二胺Fig.3 Separation of 6 compounds on the mixed-mode stationary phase. Gradient: 70～30～70A%（0～7～10 min）. Mobile phase A: 20 mmol/L NH4Ac，pH 4.5； mobile phase B: ACN.1-p-toluenesulfonic acid； 2-p-hydroxybenzoic acid； 3-benzylamine； 4-toluene；5-ethylbenzene； 6-p-phenylenediamine

3　结论

通过元素分析、离子交换当量测试，对制备的双模式固定相中的键合基团比例和含量进行了换算，验证了投料比的变化，同时发现由于空间位阻作用导致C18键合率相对较低。通过进一步的色谱行为评价，证明了制备的固定相在分离烷基苯类化合物时表现出典型的反相分离机理，分离苯胺和苄胺时表现出离子交换和反相双重作用机理。通过分离6种不同类型化合物的混合物，进一步说明RP/SCX双模式固定相在分离复杂样品方面具有一定应用潜力。

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Evaluation of RP/SCX Mixed-mode Stationary Phase

Yu Huiwen1，Ma Xiaoru1，Zheng Shuyuan1，Xu Jiwei1，2，Li Tong2，Xia Mingzhu1，Wang Fengyun1*
（1. Nanjing University of Science and Technology，Nanjing 210094，China； 2. Dalian Elite Analytical Instruments CO.，Ltd.，Dalian 116023，China）

Mixed-mode stationary phases of HPLC had been applied to analyses of complicated samples more and more because of their multiple separation mechanisms. A number of classical RP/SCX mixed-mode stationary phases were prepared by changing the feed ratio of modifying agents. Then they were evaluated and researched systematically. The ratios of -C18 to -SO3H were acquired by element analyses and ion exchange capacity tests which confirmed that the bond rates were affected by steric hindrance. The retention behaviors of hydrophobic samples and ion samples were studied under RP and IEC mode respectively. A mixture of six kinds of compounds was separated successfully. Results showed that the prepared stationary phase had double retention mechanisms of RP and IEC which offered

for this kind of stationary phase to separate complicated samples.

mixed-mode stationary phase； reversed phase chromatography； cation exchange chromatography； evaluation and research

Q65［Document Code］ A

10.11967/2016140411

Q65

ADOI: 10.11967/2016140411

国家自然科学基金面上项目（51472121），南京理工大学本科生科研训练资助项目。

⋆王风云：Tel:（025）84315190，E-mail：wangfy@njust.edu.cn 博士，教授，色谱填料的合成、改性及应用。于慧雯：Tel:（025）84315190，E-mail：1058909128@qq.com 本科。