黄芪多糖对猪瘟疫苗体液免疫和细胞免疫的影响

姚敬明，孟　帆，王娟萍，吴　忻，刘文俊，樊振华，米瑞娟，薛翼鹏，李红丽

（山西省农科院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032）

黄芪多糖对猪瘟疫苗体液免疫和细胞免疫的影响

姚敬明，孟帆⋆，王娟萍，吴忻，刘文俊，樊振华，米瑞娟，薛翼鹏，李红丽

（山西省农科院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032）

为查明黄芪多糖对猪瘟疫苗体液免疫IgG抗体与猪白细胞介素-4（IL-4）、猪干扰素-γ（IFN-γ）、猪肿瘤坏死因子α（TNF-α）三种细胞免疫因子的影响，选用黄芪多糖注射液直接稀释高效猪瘟活疫苗（细胞源）的方法进行了免疫试验。证实了黄芪多糖直接稀释猪瘟活疫苗不但可以提高猪瘟疫苗IgG抗体水平，还可以提高猪干扰素-γ（IFN-γ）、猪肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度，降低猪白细胞介素-4（IL-4）浓度，证明在使用猪瘟疫苗免疫防控中添加黄芪多糖可增强猪群免疫力，为控制猪瘟流行提供了依据。

黄芪多糖；猪瘟疫苗；细胞免疫；体液免疫

猪瘟（Classical Swine Fever，CSF），是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种以高热、出血为主要特征的烈性传染病，近几年出现了仔猪先天感染、免疫失败、母猪持续性感染等现象，给养猪业造成巨大经济损失。因此，如何有效预防和控制猪瘟已成为迫在眉睫的问题，一直以来，在猪瘟防控中，接种疫苗起着至关重要的作用，目前和以后很长一段时间里，以疫苗免疫为主仍然会是我国猪瘟防控采取的主要策略。王娟萍等2011年对山西省规模化种猪场进行了猪瘟免疫情况调研，发现猪瘟免疫抗体在山西规模化种猪场不理想，而且最差的是保育猪抗体水平。Van Oirschot用中国猪瘟兔化弱毒株免疫猪后，在第一周进行攻毒，发现免疫猪完全可以抵抗强毒的攻击，因此可以证明在抗猪瘟免疫应答的早期阶段，

细胞介导免疫具有重要的作用。为了查清仔猪接种猪瘟疫苗后产生的体液免疫和细胞免疫力的消长情况及相关性，课题组采用黄芪多糖直接稀释高效猪瘟活疫苗（细胞源）免疫接种断奶仔猪，定期检测血清中的IgG抗体和猪白细胞介素-4 （IL-4）、猪干扰素 -γ（IFN-γ）、猪肿瘤坏死因子α （TNF-α）三种细胞因子，进行统计分析，为有效控制猪瘟流行提供依据。

1　材料与方法

1.1试验药品

试验用猪瘟疫苗，选用市售河南某公司生产的高效猪瘟活疫苗（细胞源）和配套稀释液，黄芪多糖注射液由北京某公司生产，猪瘟ELISA（酶联免疫吸附试验）抗体检测试剂盒由法国Biochek公司生产，北京天之泰生物科技有限公司提供。猪白细胞介素-4（IL-4）、猪干扰素-γ（IFN-γ）、猪肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析检测试剂盒由北京永辉生物科技有限公司提供。

1.2试验设计

选择出生日期相近的28日龄断奶仔猪101头，随机分成2组，饲养同一条件下。试验1组：用高效猪瘟活疫苗（细胞源）100头份+100mL黄芪多糖注射液，30日龄仔猪首免肌肉注射1.1mL/头；60日龄二免肌肉注射1.5mL/头，共免疫50头。试验2组：用高效猪瘟活疫苗（细胞源）100头份+ 100mL配套稀释液，30日龄首免肌肉注射1.1mL/头；60日龄二免肌肉注射1.2mL/头，共免疫51头。

1.3样品采集

分别在仔猪免疫前28日龄和首免后40、50、60、70、80、90、120日龄前腔静脉采血3～5mL，分离血清，用于测定猪瘟免疫抗体IgG值和细胞因子IL-4，IFN-γ，TNF-α浓度。

1.4猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒的检测方法与判定标准

抗体检测按照ELISA检测试剂盒操作步骤进行。试验成立的条件：阴性对照孔平均OD405nm＜0.35，（阳性对照孔平均OD405nm-阴性对照孔平均OD405nm）＞0.15。判定标准：S/P≤0.499，判定为猪瘟抗体阴性；S/P≥0.500，判定为猪瘟抗体阳性。

1.5IL-4，IFN-γ和TNF-α酶联免疫分析试剂盒的检测方法与判定标准

取上述血清，严格按照猪白细胞介素-4（IL-4）、猪干扰素-γ（IFN-γ）和猪肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析检测试剂盒说明书操作，常规加底物显色，于酶标仪上测定各孔OD450nm值，根据各自标准品OD450nm值绘制各自标准曲线，然后根据标准曲线计算待测样品中IFN-γ，IL-4和TNF-α的浓度。

1.6 统计分析试验数据采用SPSS18统计学软件进行分析，用平均值±标准差表示。

2　试验结果

2.1猪瘟抗体水平检测结果

由表1可知，母猪免疫前、仔猪免疫前及首免后10d猪瘟抗体S/P平均值试验组和对照组差异均不明显。与对照组相比，试验组仔猪猪瘟抗体S/P平均值首免后20d提高33.96%，差异不显著（P＞0.05）；首免后30d提高87.04%，差异不显著（P＞0.05）；整个一免试验期提高39.51%。且试验组抗体产生快，可以维持更长时间。二免后10d试验组仔猪猪瘟抗体S/P平均值提高7.69%，差异不显著（P＞0.05）；二免后20d提高16.67%，差异不显著（P＞0.05）；二免后30d提高6.92%差异不显著（P＞0.05）；二免后40d提高15.69%，差异不显著（P＞0.05）；整个二免试验期提高11.87%。

表1　猪瘟免疫抗体S/P平均值检测结果

图1　不同免疫程序免疫抗体S/P平均值

2.2猪瘟免疫抗体阳性率检测结果

由表2可以看出，母猪和仔猪免疫前各组猪瘟抗体阳性率差异不显著。与仔猪免疫前相比，首免后10d猪瘟抗体阳性率试验组下降32.5%，对照组下降36.67%；首免后20d猪瘟抗体阳性率试验组和对照组仍维持低水平；首免后30d猪瘟抗体阳性率试验组已恢复至免疫前水平，对照组仍维持较低水平。二免后10d猪瘟抗体阳性率试验组和对照组均已恢复至免疫前水平，二免后20d和30d猪瘟抗体阳性率试验组达到100%，比对照组均高12.50%，二免后40d猪瘟抗体阳性率试验组和对照组差异较小，比对照组高9.72%。

2.3免疫前后不同时间各组血清中IL-4含量的变化

由表3可知，免疫30日龄断奶仔猪后，仔猪在40日龄、50日龄、60日龄、70日龄、80日龄时，IL-4含量均为对照组高于试验组；90日龄时，IL-4含量为对照组低于试验组；整个试验期，试验组和对照组之间IL-4含量差异均不显著（P＞0.05）。

表2　猪瘟免疫抗体阳性率检测结果%

图2　不同免疫程序免疫抗体阳性率

表3　免疫前后不同时间各组血清中IL-4含量检测结果ng/L

图3　免疫前后不同时间各组血清中IL-4含量检测结果（ng/L）

2.4免疫前后不同时间各组血清中IFN-γ含量的变化

表4可知，免疫30日龄断奶仔猪后，40日龄时，试验组IFN-γ含量低于对照组，差异不显著（P＞0.05）；50日龄时，对照组IFN-γ含量显著低于试验组（P＜0.05）；60日龄时，试验组和对照组之间IFN-γ含量差异不显著（P＞0.05），但试验组IFN-γ含量高于对照组；70日龄时，试验组IFN-γ含量显著高于对照组（P＜0.05）；80日龄、90日龄时，对照组IFN-γ含量低于试验组，差异不显著（P＞0.05）。

表4　免疫前后不同时间各组血清中IFN-γ含量检测结果ng/L

图4　免疫前后不同时间各组血清中IFN-γ含量检测结果（ng/L）

2.5疫前后不同时间各组血清中TNF-α含量的变化由表5可知，免疫30日龄断奶仔猪后，不同时间实验组和对照组之间TNF-α含量差异均不显著（P＞0.05）。40日龄时，TNF-α含量：试验组＜对照组。50日龄、60日龄、70日龄时，TNF-α含量均为：对照组＜试验组。80日龄时，TNF-α含量：试验组＜对照组。90日龄时，TNF-α含量：对照组＜试验组。

表5　免疫前后不同时间各组血清中TNF-α含量检测结果ng/L

图5　免疫前后不同时间各组血清中TNF-α含量检测结果（ng/L）

3　小结与分析

黄芪多糖是黄芪中最重要的天然有效成分，作为一种绿色安全环保的免疫增强剂已经在兽用临床中被广泛应用，具有提高淋巴细胞转化率和巨噬细胞活性、诱导干扰素产生、增强机体免疫功能等作用；具有辅助增强多种疫苗免疫的效果。

抗体水平是反映体液免疫的指标，用黄芪多糖注射液直接稀释高效猪瘟活疫苗的试验组，比用配套稀释液稀释高效猪瘟活疫苗对照组，统计分析整个试验期，试验组与对照组IgG抗体S/P平均值和猪瘟IgG抗体阳性率S/P平均值差异均不显著（P＞0.05），表明二者在提高体液免疫方面的作用是相近的，但在每个检测阶段，猪瘟免疫抗体S/P平均值和猪瘟抗体阳性率都有一定的提高，说明黄芪多糖对猪瘟疫苗的体液免疫是有增强作用的。沈美玲等研究也发现，黄芪多糖能增加机体的抗体生成细胞数，在体外可增强小鼠脾脏细胞对LPS的应答反应，而在体内黄芪多糖却抑制了脾脏细胞对LPS的应答反应，这可能由于给药后脾脏中对LPS不敏感的增生细胞所致，由此认为黄芪多糖有刺激B细胞功能的作用。Kujimura K报道，黄芪可提高大鼠抗体含量，具有提高体液免疫的功能，程志斌等研究报道，黄芪多糖能促使小鼠脾脏内浆细胞增生，促进抗体合成，从而增强机体体液免疫。这些都与本实验的研究结果是一致的。

淋巴细胞分泌细胞因子的含量是反映细胞免疫的指标之一。IL-4主要由活化的Th2细胞产生，有维持Th2细胞增殖的作用，可提高机体对抗原的体液免疫应答能力。本试验果显示，除90日龄外黄芪多糖注射液组在免疫后的各个时间点的IL-4含量均低于疫苗专用稀释液组，说明黄芪多糖注射液可降低猪血清IL-4含量，对IL-4的分泌有明显抑制作用，有增强细胞免疫的作用。

γ-干扰素（IFN-γ）是由Th1细胞和NK细胞等合成和分泌的一种低分子量的可溶性糖蛋白，IFN-γ属于Thl型细胞因子，可诱导机体免疫反应向Thl型转化而抑制Th2型免疫反应，对细胞免疫有上调作用而对体液免疫应答产生下调作用。本试验结果显示黄芪多糖注射液组在猪50，60，70，80，90日龄的IFN-γ含量均高于疫苗专用稀释液组，且在猪50，70日龄都显著高于疫苗专用稀释液组，说明黄芪多糖注射液可促进IFN-γ的分泌，有增强细胞免疫的作用。

肿瘤坏死因子（TNF）是特异性免疫应答与急性炎症反应之间的一种重要介质，是介导和调节天然免疫的细胞因子。本试验结果显示，黄芪多糖注射液组的TNF-a含量在猪50，60，70，90日龄都高于疫苗专用稀释液组，说明黄芪多糖注射液可促进TNF-a的分泌。解慧梅等将不同浓度的黄芪多糖作用于体外培养的大鼠肠粘膜微血管内皮细胞，用ELISA法测定TNF-a水平的变化，结果表明大鼠肠粘膜微血管内皮细胞在黄芪多糖的作用下，细胞分泌的TNF-a增多。邱河辉等研究证明APS对IL-2、IFN-γ和TNF-α的mRNA表达有显著增强作用，APS能促进脾淋巴细胞TH1型细胞因子mRNA表达来整体调节促进细胞免疫，说明黄芪多糖注射液有增强细胞免疫的作用。

从以上的研究可以看出黄芪多糖的确对猪瘟疫苗免疫效果有明显的增强作用，可有效的增强猪瘟疫苗细胞免疫和体液免疫反应，提高猪瘟疫苗IgG抗体水平，增加猪干扰素-γ（IFN-γ）、猪肿瘤坏死因子α（TNF-α），降低猪白细胞介素-4（IL-4）的分泌，对疫苗有辅助增效的作用。这与朱钱龙等的研究相一致。而朱辉等研究发现黄芪多糖注射液虽然不能完全取代猪瘟疫苗专用稀释液，但在某些方面优于猪瘟疫苗专用稀释液，说明黄芪多糖可以作为猪瘟疫苗佐剂和改良现有疫苗专用稀释液。这些都说明猪瘟免疫配合使用黄芪多糖，可以改善猪机体免疫机能，减少免疫抑制的发生，防止野毒感染，降低发病率。

另外，在生产中，不检测，不重视细胞免疫的情况，单纯以抗体水平高低判定猪群免疫好坏，不科学不全面。本试验为猪瘟防控提供依据，在今后检测中应重视细胞因子检测。

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10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.09.009

山西省科技攻关项目（20120311022-4）；山西省回国留学人员科研资助项目（2013-144）；山西省农业科学院重点项目（2013ZD10）；山西省农业科学院攻关项目（2012YGG32）

姚敬明（1957～），山西省太谷县人，学士，研究员，主要从事猪鸡疫病免疫防控技术研究

孟帆（1980～），山西太原人，硕士，助理研究员，主要从事猪病分子生物学检测诊断技术研究工作