高效液相色谱法测定对叶百部根蜜炙后对叶百部碱的含量

董巍，郝修洁，王超众，郭丽娜，潘虹，林宇，李晓明

(1.齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江 齐齐哈尔　161006；2.齐齐哈尔市食品药品检验检测中心，黑龙江 齐齐哈尔　161006)



高效液相色谱法测定对叶百部根蜜炙后对叶百部碱的含量

董巍1，郝修洁2，王超众2，郭丽娜1，潘虹1，林宇1，李晓明1

(1.齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江 齐齐哈尔161006；2.齐齐哈尔市食品药品检验检测中心，黑龙江 齐齐哈尔161006)

目的采用高效液相色谱法(HPLC)测定对叶百部根蜜炙前后对叶百部碱的含量。方法采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，使用迪马Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈-0.2%氨水流动相，流速1.0 mL·min-1，柱温35 ℃，检测波长254 nm，进样量20 μL。结果对叶百部碱线性范围为31.25～500.0 mg·L-1，r= 0.999 5，平均加样回收率(n=9)为99.88%，RSD为0.26%。不同产地对叶百部根中对叶百部碱含量差异较大，其中河北对叶百部根中对叶百部碱含量较高为1514.80 μg·g-1，广西产对叶百部碱含量较低为197.40 μg·g-1。蜜炙后河北、广西产对叶百部根中对叶百部碱含量分别为919.60、129.76 μg·g-1。结论该文建立的含量测定方法符合要求。对叶百部根经蜜炙后对叶百部碱的含量下降，表明蜜炙对叶百部根中生物碱类成分的含量产生了一定影响。

百部/化学;蜜炙;色谱法,高压液相

百部为百部科植物直立百部Stemonasessilifolia(Miq.) Miq.、蔓生百部Stemonajaponica(BL.) Miq.、对叶百部StemonatuberosaLour.的干燥根[1]，具有止咳、杀虫的功效。目前百部炮制工艺以蜜炙为主[2]，百部生品有小毒，对胃的刺激性通过蜂蜜炮制后可缓解，其蜜炙品常用于治疗久咳。现代研究表明蜜炙百部止咳效果优于生品[3]，但是蜜炙后该作用增强的物质基础尚不明确，相关研究已报道百部中生物碱类成分的含量测定方法，但百部通过蜂蜜炮制前后发挥镇咳作用主要成分的含量差异尚未见报道[4-7]。

百部的不同品种中以对叶百部镇咳效果最好[8]，因此本研究以对叶百部为研究对象。百部属生物碱主要发挥镇咳、止咳作用[9-10]，其中对叶百部碱是具有代表性的活性成分[11]，本研究采用HPLC方法建立对叶百部根中对叶百部碱的含量测定方法，通过该方法比较蜜炙前后对叶百部根中对叶百部碱的含量差异，分析蜜炙对百部生物碱类成分含量的影响，为生、炙对叶百部饮片的质量评价及对叶百部临床应用提供实验依据。

1　仪器与试药

1.1仪器Waters 2695 型高效液相色谱仪，Waters 2996 DAD 检测器(美国Waters公司)。Empower 工作站(美国Waters公司)；FA2004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；AL 204 电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ-500 DB超声波清洗机(昆山禾创超声仪器有限公司)；WTL-10K离心机(湖南湘仪有限公司)；微量取样器(法国吉尔森10～100 μL，100～1000 μL)。

1.2试药对叶百部药材购自广西省药材玉林中药港，河北省安国市昌达中药材饮片有限公司，由齐齐哈尔医学院郭丽娜教授鉴定为百部科植物对叶百部StemonatuberosaLour.的干燥根；对叶百部碱对照品(购自成都维克科技有限公司，含量98%，批号：6879-1-2)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国 Merck 公司)；氨水(天津市凯通化学试剂有限公司)；乙醇(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；杨槐蜂蜜(北京百花蜂业科技发展股份公司)。

2　方法与结果

2.1对照品溶液的制备取对叶百部碱对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1 mL 含1.0 mg的对照品储备液，冷藏备用。

2.2蜜炙对叶百部的制备取炼蜜25 g，加入适量沸水稀释后，与对叶百部药材200 g拌匀，闷透后用文火炒至对叶百部药材表面棕黄色时，取出，放凉备用[12]。

2.3供试品溶液的配制称取对叶百部生品及蜜炙品粉碎成粉末，取药材粉末(过3号筛)各10 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入75%乙醇100 mL，称定重量，回流提取2h，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足失重，摇匀。重复回流提取一次，合并两次滤液。取滤液于10 000 r·min-1离心10 min，滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.4色谱条件色谱柱为迪马Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.2%氨水溶液，梯度洗脱：0～5 min，45%～50% 乙腈；5～20 min，50%～50% 乙腈；20～30 min，50%～65%乙腈；流速1.0 mL·min-1；柱温35 ℃；检测波长254 nm；进样量20 μL。理论板数按对叶百部碱色谱峰计算高于5 000。对叶百部碱色谱峰与其他峰达到基线分离，峰形对称，色谱峰见图 1。

2.5线性关系的考察取对照品溶液，依次用甲醇稀释成0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·L-1的标准品溶液，精密吸取20 μL进样。记录色谱图，测定峰面积，以对叶百部碱的峰面积对浓度(mg·L-1)进行线性回归，得对叶百部碱的回归方程为Y=5.63×106X+1.54×105(r=0.9995)。结果表明对叶百部碱在31.25～500.0 mg·L-1范围内线性关系良好。

2.6精密度试验精密吸取0.125 g·L-1对照品溶液20 μL，按照“2.4”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，对叶百部碱峰面积的RSD为0.65%。结果表明该方法精密度良好。

A.对照品

B.河北生品

C.河北蜜炙品

D.广西生品

E.广西蜜炙品

2.7重复性试验精密称取对叶百部生品10 g，共6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，对叶百部碱含量的RSD为1.08%。结果表明该方法重复性良好。

2.8稳定性试验精密吸取同一供试品溶液20 μL，分别于 0、2、4、8、12、24 h进样测定，考察其稳定性，结果峰面积的RSD为0.78%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9加样回收率试验精密称取已测定的广西产对叶百部生品5.0 g，共9份，平均分为 3 组，每组分别精密加入低、中、高3个浓度的对叶百部碱对照品，按“2.3”项下方法制备样品，按“2.4”项下色谱条件进行测定，按外标法计算含量，结果见表1。

表1　加样回收率试验结果(n=9)

2.10样品含量测定精密称取不同产地对叶百部生品及蜜炙品10.0 g，平行3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，采用外标法计算含量，取3份平均值，结果见表2。

表2　对叶百部中对叶百部碱含量测定结果(n=3)

3　讨论

3.1药材产地的选取本研究所用药材购自广西省及河北省，一方面是由于广西省是对叶百部药材的主产区；另一方面，课题组曾选取对叶百部在全国的主要产区，如河北、安徽、广西等，以最低抑菌浓度为指标，进行体外抗肺炎支原体细胞实验，结果表明，河北产对叶百部抗肺炎支原体活性较强。因此，本研究选取广西省及河北省产对叶百部。

3.2提取条件的确定分别对对叶百部样品采取超声、加热回流方法进行提取，提取溶剂考察了100%乙醇、75%乙醇水溶液、100%甲醇、75%甲醇水溶液，提取用量分别考察了20、50、100 mL和提取时间30、60、100 min等因素。结果显示，用75%乙醇水溶液加热回流提取，方法简便且峰形较好。

3.3流动相的确定由于测定主要成分呈碱性，在甲醇-水或乙腈-水系统系统中色谱峰峰形较差，考察向洗脱系统中加入不同浓度氨水，最终发现以乙腈-0.2%氨水溶液作为流动相峰形最佳，分离较好。

3.4检测波长的确定对对叶百部样品进行全波长扫描(波长190～400 nm)，发现在254 nm处时对叶百部碱吸收较好，可用于含量测定，因此选择254 nm作为本研究含量测定最终检测波长。

4　结论

本研究通过对广西、河北两个产地对叶百部饮片中对叶百部碱成分的含量测定，发现对叶百部碱的含量存在差异，河北产的含量较高。经过蜜炙炮制后，广西产对叶百部中对叶百部碱含量为129.76 μg·g-1，较蜜炙前下降；河北产对叶百部蜜炙后对叶百部碱含量为919.60 μg·g-1，较蜜炙前下降，可见两个产地的对叶百部生品经蜜炙后对叶百部碱含量均降低。传统认为，百部生品有小毒，经蜜炙后可降低刺激性，本研究表明，对叶百部经蜜炙炮制后，发挥镇咳活性的主要生物碱类成分含量降低，蜂蜜是否发挥协同增效作用从而保证蜜炙品镇咳活性，还需进一步药效实验证明。

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Changes of tuberostemonine in root of Stemona tuberosa before and after stir-frying with honey by HPLC

DONG Wei1,HAO Xiujie2,WANG Chaozhong2,et al

(1.CollegeofPharmacy,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar,Heilongjiang161006,China;2.QiqihaerInstituteforFoodandDrugControl,Qiqihar,Heilongjiang161006,China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of tuberostemonine in root ofStemonatuberosaLour.during stir-frying with honey.MethodsHPLC and Diamonsil-C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm) were adopted,with acetonitrile-0.2% ammonia as the mobile phase at the flow rate of 1.0 mL·min-1.The column temperature was set at 35 ℃,and the UV detection wavelength was 254 nm.Sample quantity was 20 μL.ResultsTuberostemonine showed a good linear relationship within the range of 31.25～500.0 mg·L-1(r=0.999 5),with the average recovery of 99.88% (n=9),RSD being 0.26%.Tuberostemonine contents ofStemonatuberosaLour.in different areas had great difference.The content ofStemonatuberosaLour.purchased from Hebei was the highest,1514.80 μg·g-1,and the lowest was purchased from Guangxi,197.40 μg·g-1.After stir-frying with honey,the content of tuberostemonine were decreased to 919.60,129.76 μg·g-1,respectively.ConclusionsThe method was simple and reliable,which met the requirements.The content of tuberostemonine is decreased by stir-frying with honey,indicating that honey-processed approach had an effect on the content of alkaloids inStemonatuberosaLour.

Stemona japonica/chemistry;Honey processing;Chromatography,high pressure liquid

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12541925)

董巍,女,博士,研究方向:中药药效物质基础研究,E-mail:pingguoweiweiwei@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.017

2016-05-01，

2016-06-10)