桑叶中黄酮类成分在大鼠体内分布特征研究

王冰，孙艳涛

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连　116600)



桑叶中黄酮类成分在大鼠体内分布特征研究

王冰，孙艳涛

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连116600)

目的研究桑叶中黄酮类成分的归经特征。方法采用有效成分的组织分布分析桑叶中黄酮类成分与归经的关系。结果芦丁和总黄酮在大鼠各组织中分布广泛，芦丁在胃中分布最多，其余脏器中大部分有二次分布特点；总黄酮在肝中分布最多，在大肠中分布较多。结论桑叶总黄酮的分布特征与桑叶归肝、肺经相符合。

桑叶/药代动力学;黄酮类;芦丁;大鼠,Sprague-Dawley

桑叶为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥叶，甘，苦，寒，归肺、肝经。具有疏散风寒，清肺润燥，清肝明目的作用[1]。现代研究表明桑叶富含多糖、黄酮、生物碱、蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素等活性成分，具有降血糖、调血脂抗应激、抗衰老、抗凝血等功效[2-6]。目前关于桑叶研究较多，但多集中于食品和保健品类研究，作为桑叶中的黄酮类成分——芦丁研究较多[7]；关于桑叶有效成分的体内研究报道较少，如蒋立娣[8]以木犀草素为内标，对口服桑叶提取物后大鼠血浆中的槲皮素、山奈酚和异鼠李素进行了分析，结果三者在大鼠体内分布迅速，消除缓慢。曹旭等[9]采用灌胃给药方式，分析了桑叶总生物碱中1-脱氧野尻霉素在大鼠体内的药动学研究，结果该成分在大鼠体内符合二房室模型。为深入分析桑叶中黄酮类成分在大鼠体内的代谢特征，本研究以黄酮类成分为研究对象，分析桑叶中黄酮类成分单体与总成分在各组织中的分布差异，探索黄酮类成分的分布特征。

1　实验材料

1.1仪器Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm,5 μm)色谱柱；高效液相色谱仪( LC-10AT型双泵，配有二元梯度泵，在线脱气机,配有SPD-10AVP紫外检测器，微量进样针；日本岛津公司)；UV-mini-1240紫外分光光度计(SHIMADZU)，循环AS3120A超声波清洗机；MA110型电子天平(上海第三分析仪器厂)，FS-2型可调高速分散器(江苏省金坛市荣华仪器制造),80-2型离心机，XK96型快速混匀器(新康制造)。

1.2试药芦丁对照品(购于中国药品生物制品检定所,批号:10080-9504)；纯净水(娃哈哈纯净水)；乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司,色谱纯),水为重蒸馏水,甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司,色谱纯),乙腈；桑叶药材(市售)经鉴定为药典所载种。

1.3动物SD大鼠,雌雄各半，体质量(200±20)g，购于辽宁长生生物科技有限公司，资质号：SYXK(辽)2013-0009。

1.4对照品储备液的制备取芦丁对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1 mL含0.98 mg的溶液，即得。

2　桑叶中黄酮类成分归经分析

2.1桑叶提取液的制备取桑叶粉末(过3号筛)约50 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入1 500 mL 90%乙醇，加热回流1 h，冷却后滤过,挥干乙醇,残渣用纯净水稀释至50 mL,即得。

2.2动物组织的处理方案取大鼠组织0.35 g精密称定，加入0.35 mL 0.9%生理盐水溶液，匀浆；转移至生理盐水润洗过的样品管中，精密加入3 mL甲醇，涡旋1 min，4 000 r·min-1离心20 min，精密吸取上清液2 mL，备用。

2.3桑叶中芦丁的分布特征

2.3.1色谱条件Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)色谱柱；流动相：乙腈-水溶液(20∶80)；检测波长：330 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。

2.3.2组织处理方案按“2.2”项目处理后，于40 ℃水浴吹干上清液，精密加入50 μL甲醇，涡旋1 min，精密吸取10 μL进样分析。

2.3.3线性关系和专属性考察取空白肝组织5份，分别按“2.2”项目处理后，精密加入芦丁对照品储备溶液10、20、30、40、50 μL，于40 ℃水浴吹干，精密加入50 μL甲醇，涡旋1 min，精密吸取10 μL进样分析。以峰面积Y为纵坐标，浓度X(mg·L-1)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=0.000 005 1X+0.019 3，r=0.993 2。符合中药药代动力学研究r>0.99的要求[10]，色谱图见图1。

2.3.4方法学考察取不同大鼠脏器分别进行精密度考察、加样回收率和绝对回收率、冻融次数、短期稳定性、长期稳定性关系考察，结果RSD<2%，符合中药药代动力学要求。

2.3.5大鼠各组织中的芦丁含量差异SD大鼠4只，3只鼠按灌胃桑叶提取液4 mL，在相应时间点处死，按“2.3.2”项目处理，在“2.3.1”色谱条件下分析，结果见表1。

2.4桑叶中总黄酮的分布特征

2.4.1样品及空白组织处理方案按“2.2”项目处理后，吸取上清液用甲醇稀释至10 mL。

2.4.2对照组样品制备按“2.2”项目处理后，吸取上清液,加入对照品储备液50 μL用甲醇稀释至10 mL，即为对照品溶液。

2.4.3大鼠各组织中总黄酮的含量分析4只大鼠随机分成4组,其中2只灌胃供试品4 mL,1.5 h后取出心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃用生理盐水清洗干净,作为给药组,另外2只不灌胃,同样处理分别作为空白组和对照组。在500 nm波长下采用分光光度计采用外标一点法分析各组织中总黄酮的含量,结果见表2。

A.空白肝组织

B.灌胃给药2 h肝

C.对照品

D.空白肝加对照品

3　讨论

在进行实验之前，对乙醇浓度、提取时间、溶剂量和提取次数进行了考察，以总黄酮为考察指标经过正交实验分析，确定桑叶中总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇浓度为90%，提取时间为1 h，固液比为1∶30，提取次数为2次。

表1　不同时间点大鼠各组织中的芦丁含量结果表

表2　总黄酮测定结果

桑叶总黄酮提取实验经验证性实验测得的吸光度值为0.449 9，计算得总黄酮含量为423.97 g·L-1。与正交实验结果比较，符合最佳工艺要求。

2 h芦丁分布结果与1、3 h分布结果存在一定特异性。可能原因是芦丁为芸香苷，可在酸性条件下水解为槲皮素。胃中含有大量胃酸可能为芦丁转化的主要器官，2 h的分布结果显示芦丁在胃中大量分布，在其他脏器分布显著降低可能与此有关。

根据桑叶中芦丁在大鼠各组织中的分布特征，可见芦丁在各组织中分布广泛。1 h分布结果显示在心、肝中分布较少，其他脏器相差不大。3 h除心、肝外芦丁在各脏器中分布显著增加，在脾中最高，胃中含量有所下降，可能3 h开始是芦丁在各脏器中分布增加的开始。总的来看，芦丁各脏器中均有分布，1～3 h内在各脏器中含量均有所增加，但肝、肺与其他脏器中芦丁含量相比较低，这与桑叶归肝、肺经不符。其原因可能是采样时间不当，应对多个时间点的芦丁分布进行分析；也可能是芦丁为芸香苷，在酸性及酶条件下，可能水解，当对大鼠口服给药后，药液经胃、小肠和大肠等消化道时，其中的酸和酶会导致芦丁的水解，进而导致在各组织中芦丁含量降低，对芦丁的体内分布产生影响；更可能芦丁仅为桑叶中多种成分中的一种，无法全面体现桑叶归经的特征。

根据桑叶总黄酮的体内分布实验数据可见，总黄酮在大鼠体内分布广泛，大鼠的心，肝，脾，肺，肾，大肠，小肠，胃都有分布，其中肝中分布最多，大肠分布也较多，大肠和肺互为表里，上述数据与桑叶归肝、肺经相符合。总黄酮在胃和小肠分布较多，可能与胃和小肠为主要吸收器官有关。

[1]国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社，2010:279.

[2]林天宝,李有贵,吕志强,等.桑树资源综合利用研究进展[J].蚕桑通报,2008,39(3):1-4.

[3]汪少发.桑叶的药理价值与综合利用[J].蚕桑茶叶通报,2008(1)：11-12.

[4]原爱红,黄哲,马骏，等.桑叶黄酮的提取及其降糖作用的研究[J].中草药，2004,35(11):1242-1243.

[5]丁盈,蒋梅香,周应军,等.桑叶降糖活性成分研究[J].中国药物化学杂志,2007,17(6):386-389.

[6]应芝,孟磊,阎超,等.桑叶的降糖活性成分和药理作用[J].中草药,2002,35(5):471-473.

[7]郑芳,朱雪松,李鹏,等.HPLC-DAD法测定“武当三号金银花”不同部位中芦丁和木犀草苷的含量[J].安徽医药,2015,19(12)：2302-2305.

[8]蒋立娣.桑叶提取物中黄酮类化合物在大鼠体内的药动学研究[D].杭州：浙江大学，2011.

[9]曹旭，欧阳臻，赵明，等.桑叶总生物碱中1-脱氧野尻霉素在大鼠体内的药物动力学研究[J].中药新药与临床药理，2012,23(4)：449-452.

[10] 张振秋.体内中药分析[M].沈阳：辽宁大学出版社，2008：23.

Distribution characteristics of total flavonoids in mulberry leaves

WANG Bing，SUN Yantao

(CollegeofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Dalian,Liaoning116600,China)

ObjectiveTo explorethe channel tropism characteristics of total flavonoids from Mulberry leaves.MethodsWe analyzed the relationship between total flavonoids from Mulberry leaves and channel tropism based on tissue distribution of effective components.ResultsRutin and total flavonoids were widely distributed in various tissues of rats.Rutin was most widely distributed in the stomach and had the characterstics of twice distribution in other organs.Total flavonoids were most widely distributed in the liver,followed by the large intestine.ConclusionsThe distribution characteristics of total flavonoids in mulberry leaves are in accordance with channel tropisms of the liver and lung.

Folium mori/pharmacokinetics;Flavones;Rutin;Rats,sprague-dawley

孙艳涛,男，博士，副教授,研究方向:中药分析，E-mail:sunyt_ky@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.014

2015-11-26，

2016-06-20)