Angiopep-2介导的双靶向纳米载体研究及其在大鼠C6胶质瘤MR显像中的价值

张婧婧，王啸，徐云霞，余永强，钱银锋

(安徽医科大学第一附属医院放射科，安徽 合肥　230022)



Angiopep-2介导的双靶向纳米载体研究及其在大鼠C6胶质瘤MR显像中的价值

张婧婧，王啸，徐云霞，余永强，钱银锋

(安徽医科大学第一附属医院放射科，安徽 合肥230022)

目的制备Angiopep-2介导的双靶向纳米载体对比剂，并从细胞和动物水平评估其在胶质瘤显像中的价值。方法制备有和无Ang包裹的聚N,N-二乙基丙烯酰胺纳米对比剂(NP、Ang-NP)。分别测定C6细胞株和脑毛细血管内皮细胞(BCECs)与NP、Ang-NP共培养不同时间的荧光强度；C6细胞球对Ang-NP摄取率和竞争抑制实验；对C6胶质瘤大鼠模型行标注Ang和Gd3+的纳米合成造影剂(Ang-NP-Gd)和扎特酸葡酸(DOTA-Gd)增强扫描，比较两组肿瘤的CNR及对肿瘤边界显示情况。结果C6细胞及血管内皮细胞对Ang-NP-FITC均有明显的摄取；C6肿瘤球对三组摄取率顺序为：Ang-NP>NP>Ang-NP +Angiopep-2；Ang-NP-Gd显示肿瘤边界较DOTA-Gd更清晰；CNR随时间增大，在12 h达峰值。结论Angiopep-2与血管内皮细胞及胶质瘤细胞的低密度脂蛋白受体相关蛋白-1受体结合，具有很强的穿透血脑屏障及进入脑胶质瘤的能力。

磁共振成像/方法;纳米共轭体;神经胶质瘤;分子靶向治疗;大鼠,Sprague-Dawley

胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，发病率为(5～10)/10万人[1]；胶质瘤多呈侵袭性生长，具有不易早期诊断、治疗效果差、易复发、高死亡率等特点[2]。目前将Gd与纳米聚合物结合的纳米系统是研究脑肿瘤显像的热门方法，但是仅仅将药物与纳米粒子连接形成的非靶向纳米聚合物对比剂的显影效果仍不理想。为了提高纳米聚合物靶向效能，纳米聚合物需结合具有特殊功能的配体，常分为细胞穿透肽和主动靶向性配体。前者主要是通过提高细胞膜通透性，但缺乏对正常及异常细胞的选择性；而主动靶向性配体是通过肿瘤细胞上特殊的靶向受体-配体效应而得名，用于增加血脑屏障(brain blood barrier,BBB)的通透性[3]。低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein,LRP)在脂蛋白、蛋白酶/蛋白酶抑制剂复合体、细胞外基质蛋白等介导跨BBB转运的配体上高表达[4]；而Angiopep-2是一种序列类似于LRP的新型多肽，其跨膜转运效率明显高于转铁蛋白(Tf)[5-6]，LRP-1受体在血管内皮细胞及胶质瘤中均有表达[7]，增加了Angiopep-2通过BBB转运进入脑肿瘤。课题前期已合成经Angiopep-2修饰的纳米对比剂，本研究主要从细胞和动物水平评估其在胶质瘤中的显像价值，为脑胶质瘤的靶向性显影提供新的研究方向。

1　资料与方法

1.1材料与仪器双靶向纳米聚合物(PDEA)-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG-co-FITC)(由本课题前期合成)；Angipep-2(强耀多肽公司)；C6细胞株(中科院生物化学与细胞生物学研究所)；红细胞裂解液(碧云天生物制剂公司)；多聚赖氨酸(美国Sigma公司)；小牛血清(杭州四季清公司)。荧光分光光度计F-4600(日本 Hitachi公司)；高分辨透射电子显微镜HRTEM(美国 FEI 公司)；1.5T HDx全身超导MRI(美国GE公司)。

1.2实验动物SPF级雄性SD大鼠，体质量(265±15)g，由安徽省动物中心提供，购入后在 SPF级动物房喂养，光照/黑暗时间为12 h/12 h，环境温度为25 ℃，适应性喂养1周后进行实验操作。

1.3实验方法

1.3.1弛豫率的测定将alkynyl-DOTA-Gd、CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)分别配成浓度为0、0.005、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050、0.060 mmol·L-1，取2 mL装入5 mL离心管内，1.5T MRI，柔性线圈，行自旋回波(spin echo,SE)T1WI扫描，回波时间(echo time,TE)固定为14 ms，重复时间(repetition time,TR)分别设为300、400、500、600、800、1 000 ms，采集MRI图像，测定各浓度两对比剂的信号强度，计算出各浓度的T1值，将1/T1对对比剂浓度作图，直线的斜率为对比剂的弛豫度。

1.3.2细胞对纳米聚合物的摄取率分别以每孔浓度2×105个C6、脑毛细血管内皮细胞(BCECs)细胞接种于细胞培养皿中。24 h后置换培养基，并分别加入50 mg·L-1ANG-NP-FITC，培养30 min、2、4 h。再将C6细胞分别与NP-FITC及ANG-NP-FITC培养15、30 min、1、2、4 h后，PBS洗3次，吸去培养液，PBS 洗涤3次，离心收集，配置细胞悬液，采用流式细胞仪分析荧光强度。

1.3.3胶质瘤肿瘤细胞球实验及竞争性抑制实验(1)体外胶质瘤肿瘤细胞球的建立：吸取加有琼脂糖无血清的DMEM溶液单层平铺于培养皿(直径90 mm)，然后在每孔内加细胞浓度为2×103含有血清DMEM的细胞悬液，置于37 ℃、5%CO2的培养箱。培养第4天换液，后每2 d换液一次并观察细胞球的生长状况;(2)胶质瘤细胞球对双靶向纳米粒子的摄取率及竞争性试验：将含有异硫氰酸荧光剂(FITC)标记的纳米聚合物(200 mg·L-1)与胶质瘤肿瘤细胞球分别共培养30 min、4、24 h。用冷PBS清洗胶质瘤肿瘤细胞球4次，采用流式细胞仪测量荧光强度。竞争抑制实验将上述C6肿瘤细胞球与1 mL的Angiopep-2 (200 mg·L-1)先培养60 min后重复上述操作。

1.3.4大鼠脑C6胶质瘤模型的建立采用大鼠脑内立体定向尾状核区注射法建立C6脑胶质瘤模型[8]。

1.3.5双靶向纳米粒子在大鼠胶质瘤模型的显影效果(1)将24只雄性成年SD大鼠随机分为3组，每组8只。A组为注射标记Angiopep2-NP组，B组为非靶向NP组，C组为空白对照组;(2)于大鼠胶质瘤模型建立后第4天开始，每2 d进行一次MRI成像，直至B组全部动物均在T1WI上显示强化的肿瘤;(3)10%水合氯醛麻醉大鼠，行三平面定位扫描后，分别行颅脑及腹部MR轴位及冠状位T1WI、T2WI扫描；通过鼠尾静脉A组注入Gd3+浓度为2 mg·kg-1的纳米载体，B组注入2 mg·kg-1的Gd-DTPA组。分别于注入后即刻、10、20 min、1、4、12、24、48 h行轴位及冠状位增强T1WI，扫描参数：矩阵256×192，FOV 8 cm×8 cm，层厚1 mm，间距0.5 mm。T1WI：FSE序列TR/TE = 300 ms/9.2 ms。T2WI：FSE序列，TR/TE = 2000 ms/126 ms。NEX = 4～6。测量平扫及增强后肿瘤实性部分、周围正常组织的信号强度，背景信号的标准差，计算对比噪声比(contrast noise ratio,CNR)。

1.4统计学方法采用SPSS16.0软件对数据进行统计分析。使用配对样本t检验或者两独立样本t检验进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1双靶向纳米对比剂的弛豫率测量不同TR值、不同浓度Gd3+时Angiopep2-双靶向对比剂纳米载体和Gd-DOTA对应的信号强度，用软件计算出Gd-DOTA、CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)的纵向弛豫率分别为3.1及14.5 mmol·L-1·s-1(图1、图2)。

图1　CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)和Gd-DOTA

图2　CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)和Gd-DOTA纵向弛豫率曲线

2.2细胞摄取率在30 min、2、4 h，内皮细胞和C6细胞均摄取标有FITC的靶向对比剂；随着时间延长，细胞的荧光强度逐渐增加(图3)。ANG-NP-FITC荧光强度均明显高于NP-FITC(图4)。

注：A～C为标有FITC的Angiopep-2修饰的靶向对比剂与血管内皮细胞作用30 min、2、4 h后荧光效果；D～F为标有FITC的Angiopep-2修饰的靶向对比剂与C6细胞共培养30 min、2、4 h后的荧光效果。

图3荧光显像图

注：C6细胞与浓度为300 mg·L-1标有FITC的CD-PDEA-P(OEGMA-co-GMA(N3))和CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)在不同时间共培养后的荧光强度变化曲线，ANG-NP-FITC组与NP-FITC组相比，P<0.05。

图4各组不同时间共培养后的荧光强度变化曲线

2.3C6肿瘤细胞球摄取率及竞争抑制细胞培养24～48 h后，由5～60个细胞聚集而成的细胞团形成，但仍较疏松且存在游离的单个细胞。4 d后，细胞相互聚集呈球体，此时球体不易被吸管或其他器械冲散。随着时间的延长，细胞球体积逐渐增大。流式细胞仪显示4 h时荧光在C6细胞球边缘聚集，随着时间延长，胶质瘤细胞球中心靶向对比剂聚集明显(图5)。当C6细胞球与Angiopep-2先作用60 min再加Ang-NP-FITC后，荧光强度较前明显减低。C6细胞分别与NP-FITC、Ang-NP-FITC及Angiopep-2+Ang-NP-FITC三组共培养24 h后荧光强度见图6，ANG-NP组与Angiopep-2+ANG-NP组比较差异有统计学差异(P<0.05)。

注：A～C为ANG-NP-FITC与细胞球共培养30 min、4、24 h后荧光显像；D～F为200 mg·L Angiopep-2先与C6细胞球培养60 min后，再加ANG-NP 30 min、4、24 h后荧光显像。

图5荧光显像图

注：ANG-NP组与Angiopep-2+ANG-NP组相比，*P<0.05。

图6各组荧光强度对比图

2.4MRI测量靶向对比剂对大鼠脑胶质瘤模型靶向强化效果

2.4.1脑胶质瘤MRI增强扫描的CNR脑内胶质瘤模型建立4 d后，行1.5T磁共振分别行T1WI、T2WI序列扫描后，在10 min左右出现轻度强化，12 h时CNR达最大值，24 h时CNR出现下降，48 h时CNR进一步减低(图7)。

图7　尾静脉注射ANG-NP后不同时间的CNR值

2.4.2大鼠脑胶质瘤MRI增强扫描行Angiopep-2修饰的纳米聚合物对比剂尾静脉注射，10 min后肿瘤出现轻度强化，4 h时肿瘤轮廓显示较前清晰，且随时间延长强化越明显，12 h时肿瘤呈明显强化(图8A)；在4 h左右门静脉出现强化。而给予常规对比剂Gd-DTPA后肿瘤强化程度轻且轮廓显示较差(图8B)。

注：A为CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)注射后12 h时T1WI，肿瘤呈明显强化，且边界清晰；B为Gd-DTPA注射后10 min的T1WI，肿瘤边缘轻度强化，边界模糊。

图8大鼠脑胶质瘤MR增强

3　讨论

本课题使用的靶向纳米聚合物对比剂中的Angiopep-2(TFFYGGSRGKRNNFKTEEY)是一种新型多肽，其相对分子质量为2.4×104，通过血管内皮细胞及胶质瘤细胞上均表达的LRP-1受体介导增加跨BBB转运进入脑组织，因而得名双级靶向[9]。Hobbs等[10]证实纳米粒子直径在200～1 200 nm之间时有渗透增强和滞留效应(enhanced permeability and retention，EPR)；而平均直径接近100 nm的纳米粒子具有更长的血液循环时间且单核细胞吞噬作用减低。本课题合成的靶向纳米聚合物CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)直径约为130 nm。

本研究合成的靶向纳米聚合物对比剂的弛豫率斜率明显高于DOTA-Gd，这是由于纳米合成聚合物对比剂体积大使其旋转速率减慢，旋转相关时间延长，因而水质子的弛豫速率得到显著提高。Angiopep-2修饰的靶向纳米聚合物在活体内的生物学分布情况与NPs表面修饰有关。一方面PDEA基团是亲水性基团，纳米聚合物能延长循环时间，增强纳米聚合物EPR效应从而增加纳米聚合物的被动靶向效应；另一方面Angiopep-2修饰后能进一步识别血管及胶质瘤细胞表面的LRP-1受体，介导受体-配体特异性结合靶向的转运效应增加，导致肿瘤区域纳米聚合物进入细胞内更多。

大量研究探索能通过BBB和胶质瘤的信号通路，发现LRP-1受体能在BBB和胶质瘤细胞上同时表达[4,11-12]。进一步研究发现Angiopep-2与LRP-1受体之间有高亲和力[13-15]，因此本课题选用Angiopep-2作为穿透BBB和胶质瘤的配体。通过流式细胞仪直观观察C6细胞对靶向纳米聚合物对比剂的摄取，发现C6细胞及血管内皮细胞与FITC标记的Angiopep-2修饰的靶向对比剂共培养2 h左右出现荧光效应，证明C6细胞及血管内皮细胞上均存在LRP-1受体；随着时间延长，C6细胞与靶向对比剂作用组的荧光效应更明显，表明随时间延长，Angiopep-2修饰的靶向对比剂与LRP-1受体作用更多，因而肿瘤组织的显影效果更好。所以，Angiopep-2修饰的靶向对比剂对胶质瘤的显影有明显改善。与文献报道的结果一致[14,16]。

不同于单个细胞的培养，Zhang等[17]研究表明乏血供的肿瘤球能刺激局部实体瘤的乏血供区域，因而更接近实体瘤内局部缺氧、坏死区域缺血、低渗透效应的环境。Xin等[9]研究发现用罗丹明B异硫氰酸酯(RBITC)标记的ANG-PEG-NP组比RBITC标记的PEG-NP组在胶质瘤细胞球内的荧光效应更明显，且RBITC标记的ANG-PEG-NP组在正常脑细胞中无明显荧光表达，这与本研究结果相同。本研究采用C6胶质瘤细胞球模型来评估靶向对比剂穿透实体瘤的效率，结果显示出非靶向对比剂在C6细胞球边缘聚集，而经Angiopep-2修饰的靶向对比剂早期在细胞球边缘聚集，且随着时间延长，荧光效应明显，且胶质瘤细胞球中心区也可见靶向对比剂聚集。表明经Angiopep-2修饰的靶向对比剂主要通过与肿瘤细胞表面LRP-1受体特异性结合而具有强穿透性，证明虽然胶质瘤实体肿瘤致密，但靶向对比剂仍能通过受体介导作用渗透入肿瘤的中心；同时证明了靶向对比剂应用于肿瘤的乏血供区域的价值。而将Angiopep-2先与C6细胞作用60 min后，再加入Ang-NP-FITC培养30 min、4 h、24 h后荧光强度明显减低，与ANG-NP-FITC组荧光强度变化相比差异有统计学意义，说明Angiopep-2介导了靶向对比剂穿透C6肿瘤细胞球的效应，同时也证明了C6细胞球上存在LRP-1受体。比较NP-FITC、Ang-NP-FITC及Ang-NP-FITC+Angiopep-2组分别与C6细胞球作用24 h的荧光强度顺序为：Ang-NP-FITC>NP-FITC>Ang-NP-FITC+Angiopep-2。表明预先经Angiopep-2作用后，前者与LRP-1受体结合饱和后，靶向对比剂无法再发挥作用。表明靶向对比剂主要通过与肿瘤细胞表面LRP-1受体特异性结合而具有强穿透效率，因而Angiopep-2作为胶质瘤靶向对比剂靶向性显影的配体存在明显优势。

本研究中选取脑胶质瘤建模后第4 d行MRI检查，注射靶向与非靶向对比剂后，靶向对比剂强化程度较DOTA-Gd明显，在20 min时靶向对比剂出现强化，且随时间延长，胶质瘤边界较后者清晰，强化程度较后者明显。注射Ang-NP-Gd后CNR在10 min时出现升高，随时间延长CNR不断增大，在12 h后出现高峰，24 h时减低，48 h后进一步减低。反映了经Angiopep-2修饰的靶向对比剂具有靶向作用于血管内皮细胞及脑肿瘤，能穿透血脑屏障，靶向性显示脑胶质瘤，且能较清晰勾画肿瘤的边界。同时，CNR在24 h左右开始出现下降，说明靶向对比剂的代谢过程，也提供了进行增强扫描的时间段。

综上所述，细胞和动物实验表明，经Angiopep-2修饰的双靶向纳米聚合物对比剂通过与血管内皮细胞及胶质瘤细胞上的LRP-1受体结合，具有明显的穿透效应，增强扫描具有良好的胶质瘤靶向性、且对肿瘤边界的显示清晰，这些发现能够为胶质瘤的检出和治疗提供新的研究思路。

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Angiopep-2 mediated dual-targeting nanoparticle carrier and its value on magnetic resonance imaging of C6 glioma rat

ZHANG Jingjing,WANG Xiao,XU Yunxia,et al

(DepartmentofRadiology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230022,China)

ObjectiveTo prepare Angiopep-2 mediated dual-targeting nanoparticle and to explore its targeting ability at cellular level and in animals.MethodsC6 cells and endothelial cells were incubated with Ang-NP-FITC and NP-FITC at different time,and the fluorescence intensity was assayed.The uptake of C6 glioma spheroids to Ang-NP and its competitive inhibition were observed with flow cytometry.Ang-NP-Gd or NP-Gd was respectively injected in rat C6 glioma model.The CNR of tumors were measured and compared between two groups,and the boundaries of tumors were compared.ResultsThe uptake of C6 cells and endothelial cells to Ang-NP-FITC was obvious.The order of fluorescence intensity of C6 glioma spheroids was Ang-NP-FITC,NP-FITC and Ang-NP-FITC+Angiopep-2 in descending order.With Ang-NP-Gd enhancement,the boundary of tumors was clearer.CNR was increased by time and reached the top at 12 h.ConclusionsAngiopep-2 combined with LDL receptor related protein-1 receptor of vascular endothelial cell and glioma cell,which has very strong ability to penetrate the BBB and enter the brain glioma.

Magnetic resonance imaging/methods;Nanoconjugates;Glioma;Molecular targeted therapy;Rats,sprague-dawley

安徽省自然科学基金(No 1308085MH166)

钱银锋，男，副教授，硕士生导师，研究方向：中枢神经系统影像诊断， E-mail：894206876@qq.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.008

2016-04-17，

2016-06-20)