药用沙棘籽油质量标准研究

赵荣，李闻涛，董彬厂，陈萍

(1.陕西海天制药有限公司，陕西 咸阳　712000；2.陕西省医疗器械检测中心，陕西 西安　710075 ；3.陕西省中医研究院，陕西 西安　710045)



◇药物分析◇

药用沙棘籽油质量标准研究

赵荣1，李闻涛2，董彬厂1，陈萍3

(1.陕西海天制药有限公司，陕西 咸阳712000；2.陕西省医疗器械检测中心，陕西 西安710075 ；3.陕西省中医研究院，陕西 西安710045)

目的研究药用沙棘籽油的质量标准控制方法。方法(1)采用系列薄层色谱法(TLC)对药用沙棘籽油进行鉴别。(2)采用HPLC法测定药用沙棘籽油中的维生素E。色谱柱：Kromasil-C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-乙腈(78∶22)；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL·min-1。结果(1)采用系列TLC 法对药用沙棘籽油进行鉴别具有较好的专属性。(2)维生素E在0.197 2～1.972 mg·L-1的范围内线性关系良好(r=0.999 7)，平均回收率为99.6%(RSD=0.92%，n=6)。结论所建立的标准科学合理，可用于药用沙棘籽油的质量控制。

沙棘/标准;色谱法,薄层;维生素E

沙棘具有悠久的药用历史，古代中国藏医、蒙医都将沙棘列为重要的药用植物。1977年收载进入《中国药典》，是国家医药局和卫生部联合公布的药食同源植物。沙棘籽油是从沙棘种籽提取分离得到的脂肪油，沙棘籽油中除含不饱和脂肪酸外，还含维生素E、熊果酸等多种生物活性成分，现在广泛的用于药品、保健品及化妆品等领域[1]。其中维生素E具有组织修复，抗氧化，能增强皮肤毛细血管抵抗力，并维持正常通透性，改善血液循环及调整生育功能、抗衰老等药理作用，因此可用于治疗烧伤、冻伤、毛细血管出血，预防流产、更年期综合症、美容等。国外的沙棘保健食品种类很多，而国内的沙棘保健食品寥寥无几，其中缺乏沙棘籽油行业标准和国家标准，导致沙棘籽油的品质良莠不齐[2]，是制约了沙棘类产品的深度开发的原因之一。为了更好的适应沙棘的医药和保健用途，本文进行了沙棘籽油控制方法的研究，建立了沙棘籽油鉴别和含量控制方法。

1　仪器与试药

1.1仪器METTLER AE240型电子天平，电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)，紫外灯(上海康乐光电仪器有限公司)，硅胶G薄层板(青岛海浪硅胶干燥剂有限公司)，美国Waters 2695型高效液相色谱仪(自动进样器，2487型紫外检测器，Waters 2414柱温箱，Empower2色谱工作站)；QTSXR型超声清洗器(天津市瑞普电子仪器公司)，Millipore超纯水机。

1.2试药沙棘对照药材(中国食品药品检定研究院121519-200912)；沙棘油对照品(中国食品药品检定研究院111627-200301)；熊果酸对照品(中国食品药品检定研究院110742-200516)；维生素E对照品(中国药品生物制品检定所100062-201110)；甲醇(色谱纯，美国Merck公司)；液溴、四氯化碳、石油醚、无水乙醇等试剂均为分析纯。

1.3样品沙棘籽油陕西海天制药有限公司提供，批号：140507、140801、141001。

2　定性鉴别

取液溴0.1 mL加四氯化碳至10 mL，摇匀，量取2.0 mL置于试管中，滴入本品0.2 mL，振摇0.5 min，液体颜色由红棕色变成无色或淡黄色。

取含量项下供试品滤液蒸干后的残渣，加无水乙醇5 mL溶解，作为供试品溶液。另取沙棘对照药材4 g，同供试品溶液制备方法，残渣加无水乙醇2 mL溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部0502)试验，吸取上述两种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%的磷钼酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的蓝色斑点。见图1。

注：1.沙棘对照药材;2.供试品溶液(批号：140507);3.供试品溶液(批号：140801);4.供试品溶液(批号：141001);5.沙棘对照药材。

图1沙棘药材薄层鉴别图谱

取本品0.2 mL，加石油醚(60～90 ℃)5 mL溶解，作为供试品溶液。另取沙棘油对照品0.2 mL，同法制成对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶4∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%的磷钼酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的蓝色斑点。 见图2。

取本品2.0 mL，加水-丙酮-石油醚(60～90 ℃)-甲醇-甲酸(1∶2.5∶4.5∶1∶0.2)9.2 mL，振摇，分层，取下层溶液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取熊果酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶4∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%的硫酸乙醇溶液，在80 ℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的紫红色斑点；置紫外光灯下(365 nm)检视，显相同的橙黄色荧光斑点。见图3。

注：1.供试品溶液(批号：140507);2.供试品溶液(批号：140801);3.供试品溶液(批号：141001);4.沙棘油对照品。

图2沙棘油薄层鉴别图谱

注：1.供试品溶液(批号：140507);2.供试品溶液(批号：140801);3.供试品溶液(批号：141001);4.熊果酸;5.沙棘对照药材。

图3熊果酸的薄层鉴别图谱

3　维生素E的含量测定

3.1色谱条件色谱柱 Kromasil-C18不锈钢柱 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-乙腈(78∶22)；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃。

3.2对照品溶液的制备精密称定维生素E对照品98.60 mg，置100 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得维生素E对照品浓溶液。再精密吸取浓溶液10 mL置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得每1 mL中含维生素E 0.197 2 mg的对照品溶液。

3.3供试品溶液的制备取本品5 g，精密称定，置50 mL圆底烧瓶中，加无水乙醇20 mL，抗坏血酸2 g，沸水浴加热使沸腾，加氢氧化钾试液(40→50)10 mL，回流30 min，冷却后将溶液移入分液漏斗中，加水50 mL，用乙醚200 mL提取3次(100、50、50 mL)。合并乙醚液，用水洗涤乙醚至中性，加无水硫酸钠约3 g，滤过，滤液在水浴微热蒸干，残渣用无水乙醇溶解并定溶至10 mL量瓶中，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

3.4系统适用性试验分别精密取无水乙醇试剂空白、供试品溶液、对照品溶液(0.098 6 g·L-1)各10 μL，注入液相色谱仪，依法测定。结果表明，维生素E的保留时间约为22 min，样品中维生素E与其他组分分离完全，试剂对维生素E测定无干扰，理论板数按维生素E计算不低于5 000。见图4。

A.试剂空白

B.对照品

C.供试品

3.5线性关系考察分别精密吸取“3.2”项下对照品溶液各1、2、4、6、8、10 μL ，按上述色谱条件进样测定，以进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得线性回归方程：Y=257 655X-3 937.7，r=0.999 7。维生素E在0.197 2～1.972 μg的范围与峰面积呈良好的线性关系。

3.6精密度试验取“3.2”项下对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，记录维生素E的峰面积，并计算RSD值，结果RSD为0.97%。

3.7稳定性试验取同一批供试品溶液(批号：140507)，室温下放置，分别于0、2、4、8、12、16 h进样10 μL，依法测定。记录维生素E的峰面积并计算RSD值，结果RSD为1.33%，表明样品溶液在室温放置16 h内基本稳定。

3.8重复性试验分别精密称取同一批号(批号：140507)样品6份，按照“3.3”项下的方法制备，依法测定峰面积值并用回归方程计算含量，结果维生素E的平均含量为0.013 7 mg·g-1，RSD值为0.91%。

3.9回收率试验加样回收法，取已知含量的供试品(批号：140507)5 g共6份，精密称定，置50 mL圆底烧瓶中，分别精密加入维生素E对照品溶液(浓度为0.197 2 g·L-1)1.0、0.6 mL，按“3.3”项下方法制备，依法测定，结果见表1。维生素E的平均回收率为99.6%，RSD为0.92%。

表1　维生素E加样回收实验结果(n=6)

3.10样品测定取沙棘籽油样品3批次，分别按“3.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，以外标一点法计算样品中维生素E的含量，结果3批样品中维生素E的含量依次为：0.013 5、0.010 9、0.012 9 mg·g-1。

4　讨论

沙棘籽油是以不饱和脂肪酸为主的植物油，与液溴的四氯化碳溶液显色反应是不饱和脂肪酸的鉴别反应之一，此方法操作简便易行、检验速度快、结果明显，故作为沙棘籽油的质量控制手段。

在采用对照药材的鉴别试验中，我们选取了(1)甲苯；(2)甲苯-乙酸乙酯(8∶2)；(3)石油醚(60～90 ℃)-甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶2∶0.2)三种展开剂进行试验，其中展开剂甲苯-乙酸乙酯(8∶2)试验所得斑点更清晰、色谱信息丰富，故该鉴别试验采用甲苯-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂。

熊果酸、齐墩果酸作为医药、保健的原料，也是沙棘果的活性成分之一。在熊果酸薄层色谱预试试验，由于熊果酸和齐墩果酸斑点几乎无法分离，为确定合理的薄层鉴别指标成分，我们通过HPLC分析法考察了沙棘籽油中熊果酸和齐墩果酸的含量，结果检出熊果酸和齐墩果酸含量极低；通过文献分析发现，果皮中熊果酸是齐墩果酸2～4倍[3]，沙棘叶、果实、枝条中熊果酸是齐墩果酸2～3倍[4]，因此选择熊果酸做为沙棘籽油的质量控制手段。

针对沙棘油的主要活性成分维生素E的测定方法，已报道的有比色法、重量法、极谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法[5-10]等。其中高效液相色谱法具有专属、可靠、灵敏度高、干扰小等优点，故选用高效液相色谱法测定维生素E含量来控制药用沙棘籽油原料的质量。本研究通过反相高效液相色谱法建立测定药用沙棘籽油中维生素E含量的方法，该法简单、快速，将其列入药用沙棘籽油的质量标准，可以很好地控制其质量。

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Quality standard for seeds oil of Hippophae rhamnaides L.

ZHAO Rong1,LI Wentao2,DONG Bingchang1,et al

(1.ShaanxiHaitianPharmaceuticalCo.,Ltd,Xianyang,Shaanxi712000,China;2.ShaanxiMedicalDevicesTestingCenter,Xi′an,Shaanxi710075,China)

ObjectiveTo establish the quality standard for Seeds Oil ofHippophaerhamnaidesL.MethodsThe Seeds Oil ofHippophaerhamnaidesL.was identified by a series of TLC methods.HPLC was adopted to determine the content of Vitamin E in the seeds oil ofHippophaerhamnaidesL.Kromasil-C18column(250 mm× 4.6 mm，5 μm) was used with methanol-acetonitrile(78∶22) as the mobile phase.The column temperature was set at 30 ℃ with a detection wavelength of 280 nm and a flow rate at 1.0 mL·min-1.ResultsA series of TLC methods for the identification of the seeds oil ofHippophaerhamnaidesL.showed good specificity.For Vitamin E,there was a good linear relationship within the range of 0.197 2～1.972 mg·L-1(r=0.999 5).The average recovery was 99.6% (RSD=0.92%,n=6).ConclusionsThe standard can be use for the quality control of Seeds Oil ofHippophaerhamnaidesL.

Hippophae rhamnoides/standards;Chromatography,thin layer;Vitamin E

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.016

2016-04-21，

2016-07-07)