小鼠感染大肠杆菌O127∶H6肠炎模型的建立及受激活调节正常T细胞表达和分泌活性因子的表达

范君文， 隋丽华， 许 琴， 刘 一， 刘慧芳， 孙兆增， 闫 亮（. 军事医学科学院实验动物中心， 北京 0007； . 解放军0医院健康体检中心， 北京 0009；. 兰州军区乌鲁木齐总医院动物实验科， 乌鲁木齐 80000）

·论 著·

小鼠感染大肠杆菌O127∶H6肠炎模型的建立及受激活调节正常T细胞表达和分泌活性因子的表达

范君文1， 隋丽华1， 许 琴3， 刘 一1， 刘慧芳1， 孙兆增1， 闫 亮2
（1. 军事医学科学院实验动物中心， 北京 100071； 2. 解放军302医院健康体检中心， 北京 100039；
3. 兰州军区乌鲁木齐总医院动物实验科， 乌鲁木齐 830000）

目的 探讨大肠杆菌O127∶H6 （Escherichia coli O127∶H6）感染BALB/c小鼠建立肠炎模型及其受激活调节正常T细胞表达和分泌活性因子（RANTES）与炎症反应的相关性。方法 通过不同剂量大肠杆菌O127∶H6灌胃的方式，建立肠炎小鼠模型（实验组），灌胃生理盐水为对照组。取小鼠空肠标本，石蜡包埋，HE染色，观察病理变化； 采用荧光定量PCR的方法，测定不同剂量组感染小鼠空肠组织的RANTES表达情况。结果 成功建立了肠炎性小鼠模型，实验组与对照组比较，空肠有明显的炎性病理变化； 荧光定量PCR结果表明实验组RANTES表达量明显高于对照组。 结论 通过灌胃大肠杆菌 O127∶H6的方式可以建立肠炎小鼠模型，其空肠部位具有明显的病理变化； RANTES 表达量的变化可以作为评价小鼠肠炎的指标之一。

大肠杆菌O127∶H6； 病理变化； 荧光定量PCR； 受激活调节正常T细胞表达和分泌活性因子（RANTES）

细胞趋化因子（chemokine）与炎症反应密切相关，通常由70～90个氨基酸组成， 几乎所有的趋化因子都含有4个保守的半胱氨酸残基，根据半胱氨酸的数量和位置将其分为以下4种类型: CXC型、CC型、C型、CX3C型。受激活调节正常T细胞表达和分泌活性因子（regulated on activation normal T cell expressed and secreted，RANTES）属于CC型，作为急慢性炎症的重要介质，其表达水平的提高是炎症反应的特征之一，与多种炎性疾病有关，如关节炎、银屑病、迟发性超敏反应、肾小球肾炎、哮喘、炎症性小肠炎等［1-6］。

本实验通过灌胃的方式建立肠炎小鼠模型，观察其小肠部病理学变化［7-10］，并利用荧光定量PCR的方法分析RANTES小肠组织的表达变化情况。探讨小鼠肠炎模型的建立方法和模型有效性的评价指标。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌O127∶H6由本实验室保存； 清洁级BALB/c小鼠36只， 雌雄各半， 体质量18～22 g， 由军事医学科学院实验动物中心提供［SCXK（军）-2007-004］； 并在该中心的动物实验室饲养［SYXK（军）-2007-005］。小鼠感染O127∶H6后在P2实验室的生物安全柜饲养。反转录试剂盒和荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TAKARA）等购自大连宝生物公司。引物由Invitrogen公司合成。核酸蛋白定量分析使用Thermo Nanodrop 2000。

1.2 方法

1.2.1 菌落计数和动物模型建立 复苏保存菌种O127∶H6涂布血平板， 挑取单菌落接种10 mL LB液体培养基， 37℃， 220 r/min培养9 h， 按体积分数1%接种于100 mL LB液体培养基， 37 ℃ 220 r/min培养15 h， 稀释后， 做平板记数， 计算原始菌液中的菌液浓度。3 000 r/min离心10 min收集菌体， 用生理盐水稀释成5个剂量组， 分别为5×107CFU/mL、2.5×108CFU/mL、5×108CFU/mL、2.5× 109CFU/mL、5×109CFU/mL。

36只小鼠随机分成6组，禁食24 h后经灌胃给予生理盐水（对照组）和5个不同浓度的大肠杆菌，0.5 mL/只。每隔6 h观察小鼠活动状态并记录， 72 h后采集小肠组织， 一部分置于质量分数4%中性多聚甲醛固定，用于病理检查，一部分-80℃保存，用于提取RNA。

1.2.2 病理学检查 取已固定的空肠组织， 常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片， HE染色， 镜检，拍照。

1.2.3 总RNA的提取及cDNA的合成 利用Trizol的方法提取总RNA，用Nanodrop 2000测定其浓度和A260/280值。cDNA合成按照试剂盒说明书操作，总体积20 μL，-20 ℃保存。根据GenBank上公布的小鼠RANTES相关序列设计引物，上游引物序列为: 5'-catatggctcggacacca-3'，下游引物序列为: 5'-acacacttggcggttcct-3'。

1.2.4 实时荧光定量PCR条件优化 根据TAKARA公司提供试剂盒的反应条件设计实验。反应条件: 95 ℃预变性1 min， 94 ℃变性40 s， （50～62） ℃ 退火，40个循环做扩增曲线； 95 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、55 ℃循环133次（每隔0.3 ℃采集一次荧光信号）， 直到94.6 ℃， 做溶解曲线。在50～62 ℃确定RANTES 与gapdh最佳反应退火温度。

1.2.5 标准曲线制作、样品检测及统计学分析 将标准品按1∶5倍比稀释，按上述反应体系及条件，进行荧光定量PCR扩增，获得RANTES与gapdh基因的标准曲线。

优化条件后对样品进行检测。设立阴性对照。运用SASS软件对样品Ct值进行数据分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察

实验72 h，对照组小鼠被毛光滑，精神良好，无异常粪便； 实验组小鼠被毛蓬乱，出现不同程度稀便。

2.2 组织病理学观察

随着菌液接种剂量的增加，空肠组织的病理变化越明显。5×107CFU/mL组与对照组比较（图1A），仅见空肠固有层炎细胞浸润（图1B），2.5× 108CFU/mL组空肠固有层血管充血，有较多的炎细胞浸润，黏膜下层未见明显炎细胞浸润（图1C），5×108CFU/mL组空肠固有层血管充血、有较多的炎细胞浸润、部分上皮细胞水肿、脱落，结构不清（图1D），2.5×109CFU/mL组空肠固有层炎细胞浸润、间质血管充血、黏膜下层有少量的炎症细胞浸润，黏膜肌完整（图1E），5×109组空肠固有层炎细胞浸润，部分黏膜上皮细胞脱落（图1F）。

2.3 荧光定量标准曲线

标准品按1∶5做5个浓度梯度倍比稀释， 溶解曲线（图2）有明显单峰，且无杂峰，符合标准品要求。RANTES标准曲线斜率为-3.378， r2为0.993，扩增效率为97.7%； 内参gadph斜率为-3.157，r2为0.996，扩增效率为107.4%。由此可见，两个基因扩增效率良好，实验计算结果准确可信。

2.4 RANTES表达结果

通过分析， RANTES的表达水平与O127∶H6剂量大小有关。在实验中， 对照组与5×107CFU/mL、2.5×108CFU/mL、5×108CFU/mL、2.5× 109CFU/mL组间没有明显差异， 与5×109CFU/mL组有明显差异（P＜0.05）（图3）。

3 讨论

RANTES是β趋化因子中的一员，不仅对多种细胞有趋化作用，还可以强烈激活淋巴细胞，对T细胞及巨噬细胞具有强大的激活功能，能诱导多种炎症因子大量表达［11］。

有研究表明［4，12］， RANTES在溃疡性小肠炎串者病变组织中表达量升高； 胡建中等［13］通过ELISA方法检测特应性皮炎患者血清中RANTES水平显著高于健康对照， 且与病情活动呈正相关； 杨铬华等［6］通过荧光定量PCR的方法同样证实了RANTES mRNA的定量表达可以作为判断患者病情程度的指标之一。

A: 对照组（HE ×100）； B: 5×107CFU/mL组（HE ×400）； C: 2.5×108CFU/mL组 （HE ×100）； D: 5×108CFU/mL组（HE ×100）； E: 2.5×109CFU/mL组（HE ×100）； F: 5×109CFU/mL组（HE× 100）图 1 不同浓度Escherichia coli O127∶H6感染BALB/c小鼠后空肠病理学变化A: control group （HE ×100）； B:group of 5×107CFU/mL（HE ×400）； C: group of 2.5×108CFU/mL（HE ×100）； D: group of 2.5×108CFU/mL（HE ×100）； E: group of 2.5×108CFU/mL（HE ×100）； F: group of 2.5×108CFU/mL（HE ×100）Figure 1 The jejunal pathology of BALB/c mouse infected by different doses of Escherichia coli O127∶H6

A: RANTES标准曲线图； B: gapdh 标准曲线图； C: RANTES溶解曲线； D: gapdh 溶解曲线图 2 RANTES和gadph的标准曲线和溶解曲线A: linearity of the standard curves for RANTES； B: linearity of the standard curves for gadph；C: solubility curve of RANTES； D: solubility curve of gadphFigure 2 The standard curve and solubility curve of RANTES and gadph

1、2、3、4、5和N分别代表大肠杆菌O127∶H6 5个浓度组和对照组图 3 不同组RANTES表达的统计学分析1， 2， 3， 4， 5 and N represent 5 doses of Escherichia coli O127∶H6 groups and control group respectivelyFigure 3 The statistical analysis of RANTES expression in different groups

由于大肠杆菌 O157是肠出血性大肠杆菌，毒性和污染性较强，历史上引发过严重的污染事件。大肠杆菌O157建立的肠炎模型［14］， 除了用于研究大肠杆菌O157本身感染机制、毒力和疫苗筛选，其症状也比较严重，常引起结肠固有层出血，是出血性结肠炎模型。而大肠杆菌O127∶H6是近年来在实验动物及人类临床研究中发现的具有致病性的一类大肠杆菌，可造成肠道肠壁通透性改变、间质血管充血、黏膜下层有少量的炎细胞浸润等炎症，病变发生在空肠，主要影响消化吸收功能，所以除了可研究大肠杆菌O127∶H6的感染机制，也可以应用于开发肠黏膜的消炎药等。

本实验通过建立肠炎动物模型，应用荧光定量PCR技术，检测肠炎模型小鼠RANTES的表达量，通过SASS软件对实验结果进行数据分析，证实肠炎小鼠RANTES指标高于对照组小鼠，且与感染剂量呈正相关； 结合病理改变，随着菌液接种剂量的增加，小肠黏膜固有层炎症细胞浸润、充血逐渐明显， 部分上皮细胞水肿、脱落，结构不清；进一步证实了肠炎模型建立的可靠性，也为荧光定量PCR检测动物模型炎性反应提供了有力依据。

［1］ Selvan RS， Butterfield JH， Krangel MS. Expression of multiple chemokine genes by a human mast cell leukemia ［J］. J Biol Chem， 1994， 269（19）:13893-13898.

［2］ Nelson PJ， Ortiz BD， Pattison JM， et al. Identification of a novel regulatory region critical for expression of the RANTES chemokine in activated T lymphocytes ［J］. J Immunol， 1996，157（3）:1139-1148.

［3］ 孙卫民， 王慧琴. 细胞因子方法学 ［M］. 北京: 人民卫生出版社， 1999:734-754.

［4］ 桑云华， 卢放根， 侯恒. 嗜酸乳杆菌对实验性小肠炎小鼠肠黏膜趋化因子RANTES和MCP-1 表达的影响 ［J］. 中国药物与临床， 2010， 10（1）:13-16.

［5］ 王晓武， 张卫达， 袁彬彬， 等. 趋化因子RANTES及其受体CCR5在大鼠心肌梗死后的时程变化［J］. 第四军医大学学报， 2009， 30（14）:1278-1280.

［6］ 杨铬华， 李常兴. RANTES及趋化因子受体CCR5在特应性皮炎皮损中的表达及其意义［J］. 中国西医结合皮肤性病学杂志， 2010， 9（3）:146-148.

［7］ 李杨. 溃疡性小肠炎动物模型的建立方法 ［J］. 中药新药与临床药理， 1999， 10（2）:120-122.

［8］ 赵晓瑜， 李继刚. 实用分子生物学技术 ［M］. 北京: 化学工业出版社， 2006:47-48.

［9］ 肖国生， 曹三杰， 文心田. 荧光定量PCR技术及其在动物传染病定量检测中的应用［J］. 动物医学进展， 2005， 26（2）: 13-17.

［10］ 郑杰辉， 林炤华， 徐瑛， 等. 实时荧光定量PCR检测转基因小鼠外源性基因拷贝数方法的建立和应用［J］. 中国优生与遗传杂志， 2011， 19（2）:34-36， 80.

［11］ 梁鸣， 李幼姬， 阳晓， 等. RANTES在狼疮样小鼠肾组织中的表达及其意义 ［J］. 中华肾脏病杂志， 2001， 17（5）:323-326.

［12］ Yang SK， Choi MS， Kim OH. The increased expression of an array of C-X-C and C-C chemokines in the colonic mucosa of patients with ulcerative colitis: regulation by corticosteroids ［J］. Am J Gastroenterol， 2002， 97（1）:126-132.

［13］ 胡建中， 胡南， 赵武能， 等. 特应性皮炎RANTES、MIP-1a及趋化因子受体CCR5测定及其意义 ［J］. 中国病原生物学杂志， 2007， 2（2）:101-103.

［14］ 孙洋， 刘军， 冯书章， 等. 肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染小鼠动物模型的初步建立［J］. 实验动物科学与管理，2003， 20（4）:6-9.

Establishment of Escherichia coli O127：H6 Infected Mouse Model and Expression of Regulated upon Activation Normal T-cell Expressed and Secreted

FAN Jun-wen1， SUI Li-hua1， XU Qin3， LIU Yi1， LIU Hui-fang1， SUN Zhao-zeng1， YAN Liang2
（1. Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100071， China；
2. Physical Examination Center， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China；
3. Department of Animal Experiment， Urumqi General Hospital，Lanzhou Military District， Urumqi 83000， China）

Objective To investigate the changes of jejunal pathology and expression of regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted （RANTES） in BALB/c mice infected with Escherichia coli O127∶H6. Methods Five groups of BALB/c mouse were administered intragastrically with different doses of Escherichia coli O127∶H6 and one group administered with saline as control. The jejunum of the mouse were embedded in paraffin， and pathological changes were observed by HE staining. The jejunal RANTES expression level in the all the mice were determined by using Real-Time PCR. Results The enteritis mice model was successfully established， and significant changes of jejunal inflammatory pathology were found in model groups compared with the control group. Real-Time PCR results showed that the expression level of jejunal RANTES in the model groups were significantly higher than that of control group. Conclusion Escherichia coli O127∶H6 can cause the changes of jejunum pathology in mice by intragastrical administration， and the RANTES expression level can be used as parameter to evaluate the in enteritis mice.

Escherichia coli O127∶H6； Pathological changes； Real-time fluorescence quantitalive PCR； regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted （RANTES）

Q95-33

A

1674-5817（2016）01-0001-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.001

2015-05-05

十二五重大专项（2011ZXJ09201-031）

范君文（1981-）， 男， 在读博士， 助理研究员， 研究方向: 实验动物模型创制及病理学。E-mail: vetfjw@aliyun.com

闫 亮（1973-）， 男， 副主任医师。E-mail: yliang3@tom.com