多重PCR检测在儿童肺炎细菌性病原中的临床应用

刘妙娥　冯慧艳　赵尊

[摘要]目的 探讨多重PCR检测在儿童肺炎细菌性病原中的临床应用价值。方法 选取2015年1～7月在我院就诊的300例肺炎患儿，收集患儿呼吸道分泌物，进行细菌培养并提取DNA，利用多重PCR扩增14种呼吸道病原菌靶基因，统计分析多重PCR检测儿童肺炎细菌性病原敏感性和特异性。结果 从300例标本中，细菌培养出184株病原菌，阳性率为61.33%（184/300）。经多重PCR扩增检测118例样本呈阳性，阳性率为39.3%（118/300）。对14种病原菌多重PCR的敏感性为51.6%，特异性为68.6%，符合率为58.9%。多重PCR对SPN检出率（15.7%，47/300）高于培养（5.7%，17/300）（P<0.05）；联合检测细菌性病原检出率为80.67%（242/300），联合检测显著提高金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的检出率。结论 多重PCR技术对肺炎链球菌检测的敏感性较高，联合检测能提高儿童肺炎细菌性病原检出率。

[关键词]多重PCR；儿童肺炎；细菌性病原；临床运用

[中图分类号]R725.6 [文献标识码]B [文章编号]2095-0616（2016）05-169-04

在儿童肺炎的诊治中，明确病原很重要。近些年随着抗菌素的早期、广泛应用，使细菌培养的阳性率大大降低，给细菌性肺炎的病原学诊断增加了难度。目前临床中常用的细菌培养、免疫荧光、单PCR技术等检测方法，一般往往只能检测出一种或一类病原，无法检测出其他病原或混合感染，因此需要寻找一个多重检测或联合检测的方法来加强病原学诊断，指导临床工作和用药。本研究采用多重PCR技术检测细菌性肺炎临床标本，比较多重PCR、细菌培养、单PCR对各种病原的检出率，探讨该多重PCR技术对儿童肺炎细菌性病原的诊断价值，指导临床儿童肺炎诊治工作，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2015年1～7月在我院就诊的300例肺炎患儿，提取呼吸道分泌物，其中男204例，女96例，年龄1个月～9岁，平均年龄（5.6±1.2）岁，病程2～90d。均符合肺炎临床诊断标准，并获得父母知情同意并签署知情同意书。

1.2仪器与试剂

全自动微生物检定仪（VITEK-32）购自法国Bio Merieux；悬浮点阵仪（Luminex 100）购自美国LUMINEX；PCR仪（ABI 5700）购自美国ABI；高速离心机（Allegra X-12R）购自美国BeckmanCoulter；肺炎支原体PCR检测KIT购自广州达安基因；HAII试剂盒和ResPlex Ⅰ细菌面板均购自美国GENACO；细菌基因组DNA提取KIT购自美国AXYGEN；普通血平板培养基购自广州华鑫公司。

1.3方法

采集深部呼吸道分泌物后立即送至细菌室。（1）细菌培养及鉴定将采集的标本分别接种于普通血平板、流感嗜血杆菌巧克力培养基和肺炎链球菌培养基。流感嗜血杆菌接种后做革兰染色及X、V因子鉴定。其余菌落应用微生物鉴定仪进行鉴定。（2）提取细菌基因组、设计14种细菌特异性引物及扩增靶基因14种病原菌及其靶基因：肺炎链球菌（SPN）靶基因LytA，金黄色葡萄球菌（SA）Nuc，流感嗜血杆菌（HINF）OmpP2，肺炎克雷伯杆菌（KPN）Khe，嗜肺军团菌（LPN）Mip，铜绿假单胞菌（PA）AlgD，大肠埃希菌（ECO）Eac，鲍曼不动杆菌（ABM）Npol，奇异变形杆菌（PM）Topoiso，阴沟肠杆菌（ECL）AmpC，化脓链球菌（SPY）Mf，脑膜炎奈瑟菌（NMG）CtrA，屎肠球菌（EFCM）Ddl，肺炎支原体（MPN）MPN592，粪肠球菌（EFLS）Ddl。（3）多重PCR扩增：反应体系为35.8μL Rnase-freewater，5μL缓冲液，1μL dNTP，6μL引物，0.2μLHotstar Taq聚合酶和2μL DNA样品。反应条件参考说明书（95℃变性15min，94℃设定30s，52℃设定1min，72℃设定1min，以上进行15个循环；94℃15s，70℃90s，进行6个循环；94℃15s，52℃15s，72%15s进行30个循环；最后72%维持3min）。（4）扩增产物检测：按照悬浮点阵仪（Luminex 100）说明书进行操作。所获荧光强度中位值高于250（或为阴性平均值加5倍标准差）判定为阳性。（5）肺炎支原体荧光定量PCR检测：参考试剂盒说明书进行，同时将标本号、阴性质控及阳性梯度进行标记。循环反应条件为：93℃设定2min，93℃设定45s。55℃设定60s，循环数为10；93℃设定30s，55℃设定45s，循环数为30，分析结果。

1.4统计学分析

应用SPSS10.0软件包对统计进行分析，两组间比较采用x²检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1多重PCR与细菌培养结果比较

多重PCR检测的总体的阳性率低于细菌培养，与细菌培养比较275例多重PCR敏感性为51.6%，特异性为68.6%，符合率为58.9%。见表1。

2.2多重PCR与5种细菌培养结果比较

多重PCR对SPN检出率（15.7%，47/300）高于培养（5.7%，17/300）（P<0.05）；对HINF检出率（22.3%，54/300）与培养（203%，64/300）之间差异无统计学意义（P>0.05）。5种细菌的多重PCR与细菌培养结果比较见表2。

参考5种细菌培养，多重PCR的特异性和符合率均高于细菌培养结果，对SPN、PA的敏感性高于细菌培养的，相关指标见表3。

2.3联合检测结果分析

联合检测结果细菌性病原检出率为80.67%（242/300），联合检测提高流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌检出例数。见表4。

3讨论

世界卫生组织（WHO）在2005年公告，5岁以下儿童的死亡原因中，肺炎仍居于第一位，全世界每年死于肺炎的儿童大约有200万，其主要病原为细菌性，其次为病毒、支原体、衣原体等。在病原学诊断方法中，PCR扩增为目前应用最多的分子诊断技术，因其在敏感度、速度、安全性、准确性的优势，在难以常规培养的病原体如病毒、支原体、衣原体等的检测方面发挥了重要作用。单PCR一次只能检出一种病原或一类，在病原学的鉴别诊断方面存在缺陷，而多重PCR在一次检测中可以同时查出多种病原，已广泛应用于病原学诊断、耐药基因检测等研究领域。是病原学鉴别诊断未来发展方向，在病毒性肺炎病原学诊断方面，国内外均取得了比较满意结果。近些年，随着抗生素的早期广泛应用，增加了细菌培养检出率的难度，而采用多种方法进行联合检测可以相互补充，提高病原检出率。

本研究显示，总体看来多重PCR阳性率低于培养，可能因片段扩增的条件不一，难以均匀的对每种靶基因进行扩增，因此产物较少，从而导致敏感性的降低。而在肺炎链球菌的检测方面，多重PCR对SPN检出率明显高于培养，说明多重PCR对肺炎链球菌敏感性优于培养。联合检测细菌性病原检出率为80.67%（242/300），高于单独细菌培养的检出率，且联合检测提高流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌检出例数和铜绿假单胞菌的检出率，可以体现联合检测的优势，这与国内外其他专家学者报道一致。

综上，多重PCR技术对检测肺炎链球菌的敏感性较高，而对检测其他细菌性病原的敏感性还有待提高。多重PCR技术联合细菌培养能提高儿童肺炎细菌性病原检出率。临床工作中可以综合考虑各种检测方法的优势，灵活运用，提高病原学诊断，促进治疗。