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SCID Beige小鼠繁殖性能、脏器重量、血液生理生化指标和免疫细胞的测定

2016-10-06许文静郭建光杨东伟唐慧青袁水娟施美莲上海灵畅生物科技有限公司上海04上海斯莱克实验动物有限责任公司上海065

实验动物与比较医学 2016年2期
关键词:周龄脏器重量

许文静, 郭建光, 杨东伟, 唐慧青, 符 杰, 袁水娟, 施美莲(. 上海灵畅生物科技有限公司, 上海 04; . 上海斯莱克实验动物有限责任公司, 上海 065)

SCID Beige小鼠繁殖性能、脏器重量、血液生理生化指标和免疫细胞的测定

许文静1, 郭建光2, 杨东伟1, 唐慧青1, 符杰2, 袁水娟1, 施美莲2
(1. 上海灵畅生物科技有限公司, 上海 201412;2. 上海斯莱克实验动物有限责任公司, 上海 201615)

目的测定SCID Beige小鼠的繁殖性能、主要脏器重量、血液生理生化指标和免疫细胞比例。方法(1)选取10周龄SCID Beige小鼠15雌15雄进行配种, 测定其繁殖性能; (2)选取4周龄、8周龄和16周龄SCID Beige小鼠各30只(雌雄各半), 称体质量, 依次剖取各脏器并称重;(3)使用毛细管眼眶采血,测定血液生理生化指标; (4)利用流式细胞仪检测其T细胞及其亚群、B细胞、NK细胞。结果(1)SCID Beige小鼠妊娠率、窝产仔数和离乳率随胎次逐渐下降; (2)三个日龄段SCID Beige小鼠的脾脏重量随日龄的增加而减小,其余脏器重量随日龄的增加而增加,同日龄不同性别间肝脏和心脏重量呈显著性差异,脑重量无显著性差异; (3)SCID Beige小鼠112日龄雄鼠的白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞压积(HCT)、淋巴细胞(LYM)及LYM%与同日龄雌鼠和其他日龄小鼠差异明显; (4)SCID Beige小鼠的CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD19 B细胞,B220 B细胞和NK细胞含量极低,雌鼠T细胞含量低于雄鼠,不同性别间淋巴细胞含量无显著性差异。结论SCID Beige小鼠表现为T、B、NK细胞联合免疫功能缺陷,且不存在渗漏现象,该小鼠在肿瘤移植的应用方面具有一定优势。

SCID Beige小鼠; 繁殖性能; 脏器重量测定; 血液生理生化指标; 免疫细胞测定

随着生物医药技术的发展,人们对实验动物质量的要求越来越高,无菌小鼠、免疫缺陷小鼠在免疫和肿瘤研究中的作用越来越重要, SCID Beige小鼠就是其中之一。1979年,Roder等[1]研究表明, Beige小鼠的自然杀伤(NK)细胞活性缺乏; 1993年Mosier等[2]利用BALB/c-beige/beige同类近交系(congenic strain)小鼠将beige基因导入CB-17SCID小鼠成为scid/scid, beige/beige小鼠(或记为SCID Beige小鼠)。该小鼠毛色白化,具备SCID小鼠的B、T淋巴细胞功能缺失,同时具备Beige小鼠典型的NK细胞功能缺陷。本文对SCID Beige小鼠的繁殖性能和脏器重量、血液生理生化指标和部分免疫细胞指标进行了观测,为利用该品系小鼠进行相关研究提供基础生物学资料。

1 材料与方法

1.1实验动物

SCID Beige小鼠由上海灵畅生物科技有限公司提供[SCXK(沪)2013-0018]。10周龄小鼠30只(雌雄各半)用于繁殖; 随机抽取生产大群中28、56和112日龄30只(雌雄各半)用于脏器重量等测定。

1.2饲养管理及环境

实验小鼠均饲养在硬塑薄膜隔离包内,隔离包内的空气为100级全新风,包内温度控制在22± 2 ℃,相对湿度55%±10%,换气频率20次/h;照明12 h/d; 动物自由采食和饮水。

小鼠用饲料、垫料为上海普路腾生物科技有限公司提供[沪饲证(2014)04001], 经60Co辐照,剂量为35 kGY,基本营养成分为: 粗蛋白24.5%~25.5%, 粗脂肪5.5%~6.5%, 粗灰分6.0%~6.5%,粗纤维4.0%~4.5%, 水份≤10%, 钙1.2%~1.5%,磷0.75%~1.0%, 赖氨酸≥1.32%, 蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%。饮水为纯水酸化水(pH 3.5~4.0)。饮用水、笼具、水瓶、毛巾、镊子等物品经121 ℃, 30 min高压蒸汽灭菌后传入使用。

1.3主要器材与仪器

日立7020全自动生化仪和配套试剂(日本);Sysmex KX-21N全自动血球分析仪和配套试剂(日本); eppendorf 5427R离心机(德国eppendorf公司);流式细胞仪和配套试剂; Mettler toledo AL104电子称[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司, 可读性0.1 mg];动物固定台; 手术剪、眼科镊等常规手术器械。

1.4实验方法

1.4.1繁殖性能测定选取10周龄动物15雌15雄进行配种,记录动物各胎次窝产仔数、哺乳数、离乳数、离乳率和胎间隔。

1.4.2脏器重量测定电子天平称体质量后眼眶采血,不少于1.5 mL,再脱颈椎处死,立即剖取脾、肾、心、肝、肺、脑、胸腺,并用滤纸吸干组织表面水分,称取重量。

1.4.3血常规指标测定取20 μL全血加500 μL稀释液混匀,用Sysmex KX-21N全自动血球分析仪检测,12项指标为白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板(PLT)、红细胞体积分布宽度(RDW)、血小板平均容积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)、淋巴细胞(LYM)等。

1.4.4血液生化指标测定取0.8 mL全血置离心管内,4 ℃冰箱内放置1 h后2 800×g离心10 min,分离出血清,进行血液生化测定。13项指标为总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、钙(Ca)、磷(P)。

1.4.5免疫功能指标测定采用小鼠摘眼球取血法取外周血,加入EDTA抗凝剂。取流式管加入CD3、CD4、CD8、B220、NK的抗体, 按照编号分别加入采集的外周血50 μL, 避光染色15 min。加入红细胞裂解液500 μL, 裂解5~10 min。500×g离心5 min,弃上清。加入1 mL PBS重选细胞,500×g离心5 min,弃上清。加入200 μL PBS重选细胞, 流式细胞仪检测细胞亚群,结果分析。

1.5统计学方法

实验数据用软件SPSS19.0进行单因素方差分析, 数值以± s表示,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1繁殖性能

由表1可知,SCID Beige小鼠妊娠率、窝产仔数和离乳率随胎次逐渐下降。该小鼠很难生产第四胎。哺乳数比窝产仔数有一定下降,而哺乳数和离乳数相差不多。

表1 SCID Beige小鼠繁殖性能

2.2脏器重量

由表2可知,三个日龄SCID Beige小鼠的脾脏重量随日龄的增加而减小,56日龄和112日龄与28日龄相比呈显著性差异,但112日龄与56日龄相比无显著性差异,其余脏器重量随日龄的增加而增大。三个日龄SCID Beige小鼠同周龄不同性别间相比,肝脏和心脏重量呈显著性差异,脑重量无显著性差异。

2.3血液生理指标

由表3可知,SCID Beige小鼠同周龄不同性别间相比,呈差异显著的指标数随日龄的增大而增加。112日龄雄鼠的WBC、RBC、HGB、HCT、LYM%和LYM#指标明显差异于同周龄雌鼠和其他日龄小鼠。

表2 SCID Beige小鼠脏器重量                  mg

表3 SCID Beige小鼠血液生理指标

2.4血液生化指标

由表4可知, SCID Beige小鼠同日龄不同性别间相比,ALP指标呈显著性差异,AST、GLU、BUN、Ca和P指标无显著性差异。SCID Beige小鼠同性别28和56日龄的GLU、BUN和Ca指标无显著性差异。ALP和P随着动物日龄的增加明显下降,BUN随动物日龄的增加呈上升趋势。

2.5免疫细胞

由表5可知, SCID Beige小鼠的CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD19 B细胞、B220 B细胞和NK细胞含量极低。雄鼠T细胞含量略高于雌鼠。不同性别间NK细胞和淋巴细胞含量无显著性差异。

3 讨论

本文数据显示,SCID Beige小鼠的平均窝产仔数、离乳率要比正常小鼠如C57BL/6J[3]和KM[4]小鼠低,其第一胎次妊娠率不到70%,胎间隔相对较长且生产胎次少,所以换种频率较高,饲养难度和生产成本偏高。

体质量和脏器重量是最基本的生物学特性,是衡量SCID Beige小鼠生长状况的最直观的数据。实验数据表明,同性别SCID Beige小鼠除脾脏外所有脏器重量均随日龄的增加而增加,脾脏则相反,56日龄和112日龄的脾脏重量小于28日龄,且同周龄不同性别间差异不显著。脾脏是机体中最大的淋巴器官和免疫器官,脾脏内大量的免疫细胞是其执行免疫功能的基础[5],说明随日龄的变化,SCID Beige小鼠的免疫功能也在发生一定变化。28日龄和56日龄不同性别间呈显著性差异,推测同日龄不同性别间SCID Beige小鼠的免疫功能也存在一定的差异。

表4 SCID Beige小鼠血液生化指标

表5 SCID Beige小鼠外周血免疫细胞百分比

白细胞也称为免疫细胞(包括淋巴细胞),能吞噬异物产生抗体,在机体损伤治愈,抗御病原的入侵和对疾病的免疫方面起着重要的作用,白细胞减少可能反映免疫系统的衰弱。实验数据显示,112日龄雄鼠的WBC、LYM%、LYM#均远高于其他动物,反映了其免疫系统出现了较大变化。结果显示,随着小鼠日龄的上升,同周龄不同性别间呈显著性差异的指标数增加,反映出随日龄的增加,品系性别间差异在扩大。ALT和AST在肝脏疾病的诊断中具有较高的临床应用价值,能够反应肝细胞的损害情况,有利于各类肝脏疾病的诊断和分析[6],SCID Beige小鼠112日龄的ALT指标偏高,但AST指标不高,因此不能判定该小鼠在该日龄时存在肝脏损伤。与Charles River公司小鼠数据相比,AST数值接近,ALT和BUN数值偏低[7]。

SCID Beige小鼠是T、B、NK细胞缺陷的联合免疫缺陷模型动物, 得到了越来越多研究者的使用。本研究采用8周龄SCID Beige小鼠外周血进行测定, 证实了该小鼠T、B、NK细胞缺陷, 但雌性SCID Beige小鼠的CD3+、CD4+、CD8+T细胞和CD19 B细胞的含量都低于雄性, NK 细胞含量和淋巴细胞总含量基本相同, 只有B220 B细胞含量高于雄性。根据不同的实验需求, 研究人员可做不同的选择。

与SCID小鼠相比,SCID Beige小鼠在某些肿瘤的移植成功率更高[8],Beige基因突变引起的NK细胞活性降低虽不能作为影响细胞移植成功率的决定性因素,但有能够提高受体保留移植细胞活力和功能的潜力[9]。很多研究者已经在T细胞研究[10]、卵巢肿瘤[11]和甲状腺素[12]研究等领域中对SCID Beige小鼠有了一定的应用并取得不错的成果。本文实验结果证实SCID Beige小鼠T、B、NK细胞缺陷,且不存在渗漏现象,推测该小鼠在肿瘤移植的应用方面具有一定的优势。

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Q95-33

B

1674-5817(2016)03-0129-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.010

2015-11-24

上海市科委实验动物研究专项(13140900500)

许文静(1987-), 女, 畜牧师, 从事免疫缺陷动物模型的繁育及生物学特性研究。E-mail: 427865428@qq.com

施美莲(1965-), 女, 高级畜牧师, 从事实验动物保种、育种、免疫缺陷动物的研究以及实验动物营养学研究。E-mail: mlshi@slaccas.com

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