球后静脉注射在裸小鼠纳米粒静脉给药中的可行性探讨

杨　柳, 杨　华, 刘　云, 陈　佳, 龚明福, 舒通胜（第三军医大学新桥医院放射科, 重庆400037）

球后静脉注射在裸小鼠纳米粒静脉给药中的可行性探讨

杨柳, 杨华, 刘云, 陈佳, 龚明福, 舒通胜
（第三军医大学新桥医院放射科, 重庆400037）

目的探讨球后静脉注射在裸小鼠纳米粒静脉给药中的可行性。方法成年裸小鼠8只，随机分成2组，每组4只，分别通过尾静脉及球后静脉注射超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide, SPIO）纳米粒, 行裸小鼠肝脏磁共振（magnetic resonance, MR）快速自旋回波（fast spin echo, FSE） T2WI扫描, 测量同一层面、同一区域肝实质及邻近肌肉在增强前后的信号强度，计算信号强度变化率。结果8只裸小鼠全部穿刺成功。尾静脉穿刺平均耗时8 min 30 s，平均穿刺次数为3.7次； 球后静脉窦穿刺平均耗时约3 min 50 s，平均穿刺次数为2.3次。球后静脉及尾静脉两种方法注射纳米粒后肝脏的信号强度变化规律一致，纳米粒注射后即刻、5 min、10 min、30 min、1 h及2 h的信号强度变化率分别为：尾静脉注射66.78%±5.62%，72.92%±8.41%，73.08% ±7.68%，74.06%±7.44%，74.61%±6.28%，73.66%±4.52%； 球后静脉注射： 69.29%±7.53%，74.86%±5.84%，77.54%±6.47%，78.85%±8.23%，79.05%±4.65%，77.99%±7.73%，两者差异无显著性（P＞0.05）。结论裸小鼠球后静脉穿刺简单、可靠，可以作为尾静脉穿刺以外纳米粒注射的途径。

裸小鼠； 静脉给药； 纳米粒； 球后静脉

由于体型小、生长繁殖快、饲养管理方便，小鼠成为了哺乳实验动物中应用最广泛的实验动物之一。在既往的药物干预实验中，研究者采用的给药方式包括灌胃给药、皮下注射、腹膜腔注射和静脉注射等。其中静脉注射有起效快，血药浓度高等优点，成为最有效的药物注射方式［1］。尾静脉穿刺是静脉给药中最常见的方式，然而许多研究者认为，尾静脉穿刺技术难度大，耗时长，在需要连续、多次注药时不太方便。尤其是对于体型较小的裸小鼠而言，难度更大。球后静脉窦以前往往作为静脉取血的重要路径，球后静脉窦穿刺用于静脉给药目前报道较少，特别是在静脉推注纳米粒的可行性，目前还未见报道［2］。本部分研究拟通过裸小鼠尾静脉及球后静脉两种方式静脉给注超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide，SPIO）纳米粒，观察动物肝脏的增强效果，评价球后静脉注射在裸小鼠纳米粒静脉给药中的可行性，以期总结出合适的裸小鼠纳米粒给药途径。

1　材料与方法

1.1常规平扫

成年雌性BALB/C裸小鼠8只，购于北京华阜康生物科技股份有限公司［SCXK（京）2014-0004］，随机分成两组，每组4只，质量分数2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，采用自制的裸小鼠固定器固定。将裸小鼠俯卧位置于扫描床上（头部先进入），在裸小鼠于固定架之间的间隙内轻轻放入棉球，在保暖的同时固定裸小鼠, 降低裸小鼠的呼吸运动。采用正交小动物专用线圈于3.0 T磁共振（MR）扫描仪扫描行常规横断位平扫, 扫描序列及参数为： 轴位快速自旋回波（FSE） T2WI： 重复时间（TR）3 000 ms,回波时间（TE）65 ms, 重复次数（NEX）： 3, 层厚：2.0mm,间距0.2 mm。

1.2纳米粒的静脉注射

扫描结束后退床至定位，记录好裸小鼠的大致位置后取出裸小鼠，采用4.5号穿刺针行尾静脉和球后静脉窦穿刺。尾静脉穿刺前先用温水浸泡鼠尾3 min，用酒精棉球擦拭尾巴，使血管扩张，用左手食指、中指及拇指将鼠尾固定，右手持针，针尖朝下，针孔向上，从食指稍上方进针，进针后，沿着血管让针头在血管里前行一段，用回抽或逆向按揉血管可以看到回血后，用拇指固定针头，连接预先抽有铁浓度为45 μg/mL的SPIO悬液的1 mL注射器，缓慢注射对比剂。球后静脉窦穿刺参考Yardeni等［2］的方法。裸小鼠取左侧卧位，头偏向右侧，操作者左手拇指和食指轻轻挤压眼圈的背侧和腹侧皮肤使眼球轻轻突出，右手持针，针孔面向下，针尖倾斜30°缓慢的从内眦沿着眼球边上进针，直至眼底，连接1 mL注射器，轻轻回抽确定穿刺成功，然后轻轻的、缓慢的注射对比剂。注射完成，再缓慢地，轻轻地将针退出。两种方法注射的纳米粒总量均为0.15 mL。

1.3增强扫描及数据分析

按平扫时的初始位置固定裸小鼠, 进床至扫描位, 行肝脏连续的FSE T2WI增强扫描，扫描参数同平扫。扫描时间点分别为注药后即刻、5 min、10 min、30 min、1 h及2 h。扫描结束后，测量同一层面、同一区域肝脏实质部分及邻近肌肉在增强前后的信号强度, 设感兴趣区（Region of interest, ROI）为6 mm2, 并计算信号强度强化率（△SI）, △SI= SIen-SIpl）/ SIpl×100%, 其中SIpl和SIen分别为平扫和增强后的信号强度, 比较两种方法有否差异。采用SPSS 13.0 统计软件, 计量资料以±s表示。采用两随机样本均数t检验进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1穿刺情况

8只裸小鼠全部静脉穿刺成功。从平扫结束取出裸小鼠开始计时, 尾静脉穿刺平均耗时8 min 30 s,平均穿刺次数为3.7次，最多一只裸小鼠穿刺6次才成功； 球后静脉窦穿刺平均耗时约3 min 50 s，平均穿刺次数为2.3次，最多穿刺4次。尾静脉穿刺次数越多，随着鼠尾的肿胀，穿刺难度越大。尾静脉穿刺组1只裸小鼠的尾部在反复尾静脉穿刺后出现水肿, 3 d后坏死, 其余裸小鼠穿刺后连续观察1周未出现明显并发症。

2.2注射SIPO后信号强度

两种方法注射SPIO后信号强度变化见表1，信号强度变化规律一致, 注射纳米粒后即刻肝脏信号急剧降低, 5 min、10 min、30 min信号降低程度逐渐放缓, 30 min、1 h和2h信号改变不明显（图1）。在注药后即刻、5 min、10 min、30 min、1 h及2 h, 各时间点信号强度变化率分别为： 尾静脉注射66.78%±5.62%，72.92%±8.41%，73.08%± 7.68%, 74.06%±7.44%，74.61%±6.28%, 73.66% ±4.52%； 球后静脉注射： 69.29%±7.53%, 74.86% ±5.84%, 77.54%±6.47%, 78.85%±8.23%, 79.05% ±4.65%, 77.99%±7.73%。两者差异无显著性（P＞0.05）。肌肉信号在注射对比剂后即刻轻度降低,后缓慢回升, 到30 min后信号恢复到增强前。

表1　球后静脉注射和尾静脉注射两种方法注射SPIO后肝脏信号强度变化

3　讨论

裸小鼠自身免疫系统存在缺陷，成为构建人肿瘤动物移植瘤模型的最佳选择，在肿瘤发生、发展机理，肿瘤药物研发等领域中发挥着重要的作用［3］。在既往的裸小鼠移植瘤的药物干预实验中，研究者采用的给药方式包括灌胃给药、皮下注射、腹膜腔注射和尾静脉注射等。其中尾静脉注射有起效快，血药浓度高等优点，成为被广泛采用的给药方式。然而，裸小鼠尾静脉较细小，对一般实验人员来说穿刺难度较大，往往导致静脉穿刺失败。此外，为了提高尾静脉穿刺的成功率，操作者往往需要将裸小鼠进行制动，并需要用红外灯照射或采用热水浸泡鼠尾的方法使外周鼠尾静脉扩张，给穿刺操作带来了不必要的额外操作［3］。球后静脉窦是由眶上静脉、下眼睑静脉、鼻背静脉和颞浅静脉等汇聚成的静脉池，相对尾静脉，球后静脉窦更粗，穿刺注药操作更简单，对操作者的技术熟练程度要求较低，近年来受到越来越多普通实验人员的亲睐。目前已有研究证明，球后静脉窦穿刺注射的方法在进行骨髓移植、白血病诱导、静脉输注实验用混合物、以及基因治疗时实用、可靠［4, 5］。然而，关于这个方法用于静脉给药目前报道较少，特别是在静脉推注纳米粒对增强效果的影响，目前还未见报道。基于以上因素，本研究探讨了通过球后静脉窦和尾静脉注射纳米粒进行MR增强扫描的可行性和其对增强效果的影响。研究结果表明，相对于尾静脉，通过球后静脉窦注射SPIO的方法简单、高效、成功率高，且具有很高的重复率。球后静脉窦给药组未见任何并发症，而尾静脉给药组出现了肿胀、坏死的情况。测量不同方法给药后肝脏的信号强度发现两者的变化规律一致，在注药后即刻、5 min、10 min、30 min、1 h及2 h，各时间点信号强度变化率没有统计学差异。

图1　球后静脉注射SPIO后肝脏MR图像

在实际操作中，作者体会到球后静脉注药时阻力较小，即便如此，注药速度仍不能太快，据报道［6］，过高的球后注射压力可以使药物渗透到球后周围间隙。关于注药总量，有研究者报道［7］在成年小鼠注药量可达到200～300 μL, 也有学者［2］提出小鼠注药量不能超过150 μL, 因为对于体质量 30 g的小鼠，其体内的血液总量大约2.2 mL（占体质量的7.2%），即使是缓慢注射总量为200～300 μL对比剂，也会引起短暂血管超负荷。在本实验中，裸小鼠体质量约15 g，通过缓慢推注对比剂150 μL后，部分裸小鼠的确出现呼吸急促的症状，但所有裸小鼠最终都能从麻醉中自然苏醒。鉴于此，作者认为，裸小鼠常规注药量应控制在100 μL左右，如实验确需更大剂量，应缓慢、分节注射，而不能连续快速注射，且总量不能超过150 μL。

静脉注射纳米粒以后，纳米粒很快被血浆蛋白调理而被清除，主要被肝脏和脾脏吸收，少量被肺、肾、心脏和脑吸收［8,9］。分子影像是目前评估纳米粒的药代动力学的最直观、可行方法，通过肝脏磁共振信号改变来判断纳米粒的在体内的循环是观察磁性纳米粒在体内血流动力学的重要方法。本实验结果显示，肝脏信号的变化规律与文献报道的纳米粒的药代动力学一致［10］，表明两种静脉途径给药均是有效的。球后静脉注射信号强度变化率较尾静脉注射更大，这可能与球后静脉相对尾静脉更粗, 对比剂通过更顺畅有关。说明两种方法均可用于纳米粒的注射，但球后静脉注射更流畅。

即便球后静脉窦穿刺注药操作简单，注药可靠，对操作者的技术熟练程度要求较低，但对于新手而言，在正式实验之前，仍需在终末期麻醉小鼠上进行反复的穿刺试验。此外，作者体会到球后静脉给药的过程中，动物不免会发生位置的移动，这对于需要注药前后同一位置准确对比的实验来说定位要求更高。总之，对于尾静脉穿刺尚不十分熟练的操作员来说，球后静脉穿刺是一种重要的补充方法，尤其对于纳米粒的注射，球后静脉路径或可作为首选路径。

［1］ Leonrico D, Fernndezgarc AM, Aldea M, et al. Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retroorbital venous sinus and the lateral vein： alternative routes for bone marrow transplantation in mice［J］. Lab Anim, 2015, 49（2）：132-141.

［2］ Yardeni T, Eckhaus M, Morris HD, et al. Retro-orbital injections in mice［J］. Lab Anim, 2011, 40（5）：155-160.

［3］ Suckow MA, Danneman P, Brayton C. The laboratory mouse［M］. Boca Raton： CRC Press Inc, 2001.

［4］ Yan S, Fu Q, Zhou Y, et al. High levels of gene expression in the hepatocytes of adult mice, neonatal mice and tree shrews via retro-orbital sinus hydrodynamic injections of naked plasmid DNA［J］. J Control Release, 2012, 161（3）：763-771.

［5］Li S, Li T, Luo Y, et al. Retro-orbital injection of FITC-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels［J］. Mol Vis, 2011, 17：3566-3573.

［6］Sharma N, Everingham S, Zeng LF, et al. Oncogenic KIT-induced aggressive systemic mastocytosis requires SHP2/ PTPN11 phosphatase for disease progression in mice［J］. Oncotarget, 2014, 5（15）：6130-6141.

［7］Fox JG, Barthold S, Davisson M, et al. The Mouse in biomedical research： diseases［M］. San Diego： Academic Press, 2006.

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Feasibility Study on Intravenous Administration of Nanoparticles via Retrobulbar Vein in Nude Mice

YANG Liu, YANG Hua, LIU Yun, CHEN Jia, GONG Ming-fu, SHU Tong-sheng
（Department of Radiology， Xinqiao Hospital， Third Military Medical University， Chongqing 400037， China）

ObjectiveTo explore the feasibility of retrobulbar vein injection of nanoparticles in nude mice. MethodsEight healthy adult nude mice were randomly divided into two groups with four in each group. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles （SPIO） were intravenously injected via tail vein and retrobulbar vein, respectively. Magnetic resonance （MR） FSE T2WI were performed on liver of nude mice. The signal intensity （SI） of the liver and adjacent muscles were measured, and the change rate of SI were calculated. ResultsAll the 8 nude mice were punctured successfully. It took an average of 8 minutes30 seconds and 3.7 times for tail vein puncture, which was larger than that of retrobulbar vein puncture which took an average of 3 minutes 50 seconds and 2.3 times. The liver SI enhancement is consistent between retrobulbar vein injection and tail vein injection. The SI change rate at 0 minute, 5 minute, 10 minute, 30 minute, 1 hour and 2 hour were 66.78%±5.62%, 72.92%±8.41%, 73.08% ±7.68%, 74.06%±7.44%, 74.61%±6.28%, 73.66%±4.52% respectively in tail vein injection and 69.29%±7.53%, 74.86%±5.84%, 77.54%±6.47%, 78.85%±8.23%, 79.05%±4.65%, 77.99%±7.73% respectively in retrobulbar vein injection. The difference was not statistically significant （P＞0.05）. ConclusionThe intravenous administration of nanoparticles via retrobulbar vein is simpler andefficient, it may be used as a method apart from the tail vein injection .

Nude mice； Intravenous administration； Nanoparticles； Retrobulbar vein

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0117-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.007

2015-09-16

国家自然科学基金（ 81501521）； 重庆市前沿与应用基础研究一般项目（cstc2015jcyjA1338）

杨柳（1981-）, 女, 主治医师, 主要从事分子影像学研究。E-mail： 13527547568@163.com

龚明福, 博士。E-mail： yanghua780819@163.com