Prss37 基因转录起始位点的确定及其转录调控的初步探讨

王津津, 匡昉哲, 庄　华, 陆翠杰, 匡　颖（. 上海南方模式生物科技发展有限公司, 上海00；. 上海南方模式生物研究中心, 上海00；. 同济大学 生命科学与技术学院, 上海 0009）

Prss37 基因转录起始位点的确定及其转录调控的初步探讨

王津津1, 匡昉哲2, 庄华1, 陆翠杰3, 匡颖2
（1. 上海南方模式生物科技发展有限公司, 上海201203；2. 上海南方模式生物研究中心, 上海201203；3. 同济大学 生命科学与技术学院, 上海 200092）

目的确定Prss37基因的转录起始位点，并利用转基因技术在整体水平验证该启动子的组织特异性。方法运用cDNA 5’末端快速扩增法（5’RACE）对C57BL/6J小鼠睾丸mRNA进行分析，确定Prss37的转录起始位点； 构建Prss37内源启动子区域转录起始位点上游不同长度DNA片段（1 kb、2 kb、4 kb）驱动的荧光素酶基因表达的质粒；通过受精卵雄原核显微注射技术获得上述三种启动子驱动荧光素酶基因表达的转基因小鼠；利用活体成像技术观察荧光素酶基因的表达，明确启动子的组织特异性。结果Prss37基因的转录起始位点位于NCBI GeneBankTM （NM_026317.2）报道序列上游的40 bp处； 成功获得三种转基因小鼠，其中1 kb启动子驱动的转基因小鼠检测到荧光素酶基因的表达，且在脑、睾丸和附睾组织中的表达较强。结论明确Prss37的转录起始位点，成功获得了睾丸和附睾表达荧光素酶基因的转基因小鼠，为进一步的Prss37基因转录调控研究奠定了基础。

Prss37基因； 转录； 转基因小鼠； 荧光素酶基因

哺乳动物的受精是一个连续的、多步骤的过程，射出的精子需要在雌性生殖道内获能，并完成从子宫到输卵管的迁移，与位于输卵管壶腹部的卵子相遇，实现精卵结合，进而通过顶体反应、皮层反应等过程完成精卵融合［1,2］。

丝氨酸蛋白酶超家族是发现最早，也是最大、最多样的酶家族之一，其在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用［3］，已有证据表明，丝氨酸蛋白酶在受精过程中发挥了重要作用，参与精子获能、精卵结合等生理过程［4-7］。Prss37是一种胰酶样丝氨酸蛋白酶，其基因特异性地表达在小鼠的睾丸组织。课题组的研究已证实，Prss37基因纯合缺失的精子无法完成从雌鼠子宫向输卵管壶腹部的迁移，且精子与卵子的识别、结合能力也显著下降，致使小鼠雄性不育［8］。Prss37蛋白在进化上相对保守, 人和小鼠的同源度高达91%，Prss37基因为人类男性不育诊断和治疗方面提供新的方向，也为相关避孕药物研发提供了新的靶点，通过抑制该蛋白或促进该蛋白的表达，在不影响睾丸发育和精子的情况下达到正常避孕或提高受孕率的效果。

活体动物体内光学成像技术是近年来一种新兴的生物发光成像技术［9-11］。利用该技术, 研究人员将报告基因［如荧光素酶（luciferase）或者绿色荧光蛋白等］克隆在特定基因的启动子序列下游, 利用转基因小鼠技术导入到小鼠基因组中, 获得可遗传的转基因小鼠品系, 这些小鼠被称之为报告小鼠（reporter mice）,利用体内光学成像技术在不伤害小鼠的情况下，可实时定量地检测小鼠体内荧光素酶的表达，反映活体中被研究基因转录的实时变化和表达位置。Prss37基因的转录调控研究至今未见报道, 作者通过cDNA5’末端快速扩增（5’RACE）技术成功明确该基因的转录起始位点，构建了不同长度启动子片段驱动荧光素酶表达的转基因小鼠，成功获得了在睾丸和附睾组织中表达荧光素酶基因的小鼠，为进一步的Prss37转录调控机制研究提供理论和技术支持。

1　材料与方法

1.1实验动物

SPF级C57BL/6J、基因工程小鼠等由上海南方模式生物科技发展有限公司繁育生产［SCXK（沪）2014-002］和研发，所有小鼠均饲养于上海南方模式生物研究中心SPF级动物设施［SYXK（沪）2013-0035］，实验动物的使用与管理严格遵从国际实验动物评估与认可管理委员会（AAALAC）的规定，实验方案得到中心实验动物使用管理委员会的批准。

1.2质粒和菌株

D-H5α为天根公司产品，pMD18-T载体购自TaKaRa公司, pGL3-basic vector购自Promega公司。

1.3试剂

各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq酶、PCR及RT-PCR相关试剂等均购自Takara公司，蛋白酶K购自Amresco公司。常规化学试剂主要购自Sigma-Aldrich公司、上海国药集团和生工生物工程（上海）有限公司, 荧光素钾盐（Potassium Lucifein）购自Gold Biotechnology公司，Luciferase Assay System购自Promega公司，Trizol试剂购自nvitrogen或Takara公司，SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒为Takara公司。

1.4引物

所有引物均采用PrimerSelect 软件包根据序列资料自行设计，由上海生工生物技术公司合成，引物终浓度均为10 μmol/mL，引物序列如下。

5’RACE引物：

ower1： GGGGGATGTCTACCGGAGCCAGCA；

ower5： CAGCAGAGGCCGGAATCTTCTGCTCAC

载体构建引物：

P1： ACC CTCGAG CTGTCACTGTTTCATCACTCAGATATCATCAC

P2： AAT ACGCGT GACCCAGAAATGAACCCAC-

ACACC

P3： TAG ACGCGT ACCGTTGCTGTGCTTCC-TCTA

P4： CTG ACGCGT GCAGTAAATGGGAGCAAAGAACTTCAC

小鼠基因型鉴定引物：

Pre40： GTGATGATATCTGAGTGATGAAACAGTG；Plower： GTCACATCTCATCTACCTCCCGG；

小鼠Luciferase表达检测引物：

Luciferase-F： GCCAAAAGCACTCTGATTGAC

Luciferase-R： CCATATCCTTGCCTGATACCTG

RT-PCR所用引物：

Actb F： TACCCAGGCATTGCTG-ACAGG

Actb R：ACTTGCGGTGCACGATGGA

Prss37 R： CCTGCCACCTTCAA-CCACAA-3

Prss37 R： GGCTGCTTCCTTGTT-GAGT-3

1.55’ cDNA末端快速克隆（5’RACE）

小鼠睾丸组织总RNA用Trizol法抽提，利用紫外分光光度计测定并计算A260/A280比值。根据已知小鼠Prss37的基因组序列采用PrimerSelect软件设计2条用于5’RACE的基因特异性引物（lower1和lower5），这种方法能最大程度保证完整的钓取Prss37基因的5’端序列及其可能的剪接变异体。实验采用Clontech公司的SMARTer RACE cDNA Amplification试剂盒进行，之后用胶回收试剂盒回收5’RACE扩增产物，与pMD18-T载体连接，用DH5α感受态进行转化，涂板，之后挑取克隆并将筛选为阳性的克隆进行测序。运用DNA测序和生物信息学分析等方法，将小鼠Prss37基因转录起始位点与Ensembl数据库（http://www.ensembl.org/ index.html）中已公布数据的进行比较。

1.6小鼠Prss37启动子不同长度片段载体的构建

运用生物信息学分析，在经实验确认的转录起始位点之后第一个ATG之前，分别用引物P2和P1、P3和P1以及P4和P1，以C57BL/6J成年雄鼠睾丸组织的cDNA为模板，用PrimeSTAR高保真酶进行PCR扩增，分别获得长度约4 kb、2 kb 和1 kb的PCR产物，这些产物通过T4连接酶分别连接到pMD18-T的载体上，之后将连接产物转化DH5α感受态，挑取克隆，抽质粒，并将所得到的质粒进行序列分析，将序列结果正确的质粒经Mlu I及Xho I双酶切，定向克隆到pGL3-Basic载体上，构建含有Prss37启动子序列和荧光素酶报告基因的重组质粒。

1.7转基因小鼠的制备

通过Not I和Sal I双酶切以获得线性化的转基因质粒，质量分数1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收纯化包含Prss37启动子驱动的荧光素酶表达所需原件的片段，受精卵雄原核显微注射建立了转基因小鼠，受精卵供体为C57BL/6J小鼠。

1.8转基因小鼠的繁育及基因型鉴定

各转基因小鼠品系的繁殖始终维持在C57BL/6J背景。小鼠出生后，剪鼠尾进行裂解及基因型鉴定，在转基因小鼠的基因组上分别设计5’端启动子区域的Pre40及3’端荧光素酶基因区域的plower引物以进行PCR鉴定。其反应条件为：95 ℃变性4 min, 95 ℃ 30 s变性、60 ℃ 30 s退火以及72 ℃30 s延伸，扩增34个循环后，72 ℃ 10 min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，阳性小鼠应能扩增出612 bp大小条带，对照小鼠应没有条带出现。

1.9转基因小鼠RNA水平表达分析

不同组织的总RNA采用Trizol法（Invitrogen, Carlsbad, CA）抽提，步骤按说明书操作。所有RNA均用DNA酶处理。mRNA表达水平利用半定量和荧光定量PCR进行研究。β-actin用作内参。荧光定量PCR使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（Takara, 大连, 中国）, 在Eppendorf的Mastercycler系统上操作。反应条件设置为： 94 ℃ 30 s，60 ℃20 s，72 ℃ 20 s，运行40 个循环，每个样品做三个复孔。目标产物与非特异扩增产物的区分通过熔解曲线分析实现。荧光素酶基因的表达水平根据β-actin的含量进行标准化处理。

1.10荧光素酶蛋白水平表达的检测

1.10.1活体荧光素酶的化学发光检测分析采用IVIS（In Vivo Imaging Systems）成像系统（Xenogen），每只待测小鼠腹部剃毛并且腹腔注射150 μL的荧光素钠盐（15 mg/mL，以PBS为溶剂）。小鼠用异氟烷/氧气系统麻醉，荧光素钠盐注射12 min后，小鼠被置于成像系统的观测设备中成像，小鼠在暗盒中成像3 min。图像的荧光强度使用Living Image software （Xenogen）进行分析。

1.10.2体外荧光素酶活性的检测小鼠断颈处死后，取50～100 mg各待检测组织，加入500 mL的裂解液（Promega）匀浆，4 ℃，12 000 r/min，离心15 min, 取上清即为蛋白样品。使用 Luciferase Assay System试剂盒（Promega），用化学发光检测仪Luminometer TD-20/20（Lumat LB9507）检测荧光强度。组织蛋白浓度采用BCA法测定（Pierce），定量后将测得的荧光数值用蛋白浓度来标准化，得到每毫克蛋白的荧光值。

1.11统计学分析

定量结果（平均值±标准误差）以图形方式呈现。观察到的统计学差异使用One-way ANOVA（方差分析）检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.15’RACE分析Prss37基因的转录起始位点

采用5’RACE技术，成功鉴定了Prss37基因的转录起始位点。5’RACE结果显示Prss37基因转录本的起始位点比现有N C B I数据库中（NM_026317.2）公布的位置向前推移了40 bp, 即现已公布的转录起始位点位于实际的+40的位置（图1）。新发现的转录起始位点被设定为新的+1，在以下的研究中涉及到的位置信息均在此基础上编号。

2.2Prss37启动子驱动荧光素酶基因表达的小鼠的构建

本实验室前期研究结果［8］表明，Prss37基因在小鼠睾丸中的精子塑形过程中特异性表达，在其它组织和其它时相均未见其表达。由于没能找到内源性表达该基因的细胞系，及该基因为精子塑形过程中表达的特点，因此在睾丸原代培养的情况下，不论是表达该基因的精子细胞数目还是转染效率，均无法在体外筛选该基因启动子的序列。基于上述情况，并结合以往对启动子结构的认知，作者分别选取了不同长度的启动子序列拟构建带有荧光素酶报告基因的载体，以期获得转基因小鼠，并通过所能观察到的转基因阳性小鼠体内荧光素酶的时空特异性表达情况来分析Prss37启动子的具体长度及其可能的机制

PCR结合测序技术获得大约1 kb、2 kb、4 kb 的Prss37启动子序列，并将其克隆到pGL3-Basic vector上，构建由Prss37启动子驱动的荧光素酶（Luciferase）报告基因载体，三种启动子的转基因质粒结构图见图2。酶切鉴定及DNA测序正确后，用Not I和Sal I进行线性化，将所获得的DNA片段用于外源基因的受精卵（C57BL/6J背景）雄原核显微注射，所获得的小鼠进行PCR检测，阳性小鼠即为首建鼠。

三种启动子序列均获得转基因阳性鼠（表1）。三种启动子的转基因首建鼠的基因型鉴定结果详见图3。

图1　Prss37基因的启动子序列

表1　三种转基因小鼠显微注射结果

2.3转基因小鼠的繁育及活体荧光素酶基因表达的检测

三种转基因首建鼠与C57BL/6J小鼠交配，经繁育1 kb 启动子的转基因小鼠有6只首建鼠成功建系, 后代小鼠经活体成像分析仅49#首建鼠的后代观察到荧光素酶的表达（图4A），后续仅对49系小鼠进行繁殖；2 kb 和4 kb 启动子的转基因小鼠分别有4只和7只首建鼠成功建系，后代均未检测到荧光素酶的表达。

在49系首建鼠的传代过程中，发现16只F1代小鼠中有11只为阳性鼠，明显高于后代中应有50%阳性鼠的理论值（8只），此现象可能归因于普通转基因技术的多位点、多拷贝插入的特点。

取1 kb-49系F2代的小鼠通过小动物活体成像系统进行活体荧光的采集，结果显示由不同的F1代小鼠繁育出的F2代阳性雄鼠的发光情况并不相同，推测与插入片段的整合位点有关。

图2　三种启动子-荧光素酶转基因质粒结构图

图3　三种转基因首建鼠的PCR

2.4转基因小鼠荧光素酶基因表达的组织特异性为了确定荧光素酶基因的组织表达谱, 取转基因雄鼠的10个不同组织［脑（Briain）、唾腺（Salivary gland）、胸腺（Thymus）］、心脏（Heart）、肺（Lung）、肝脏（Liver）、脾脏（Spleen）、肾（Kidney）、睾丸（Testis）、附睾（Epididymis）进行RNA的抽提及反转录，并通过RT-PCR检测，结果显示荧光素酶基因在各检测组织中皆有一定量的表达, 其中, 脑, 睾丸和附睾组织中高表达（图4 B）。

同时抽提上述10种组织的蛋白，通过化学发光检测仪Luminometer TD-20/20 （Lumat LB9507）检测，显示荧光素酶基因在转基因小鼠中的表达谱与RNA水平的相同（图4 C）。

图4　启动子-1 kb转基因鼠荧光素酶基因表达检测

2.5转基因小鼠荧光素酶基因表达时空特异性

通过对转基因鼠睾丸及附睾组织蛋白的体内、体外荧光素酶活性的检测，表明睾丸组织中荧光素酶从第一周就开始有表达，到第二周之后表达量趋于稳定。而在附睾中则从第二周开始有表达，并逐渐升高, 到第6周最高, 到第八周开始又有所下降图5）。以上结果提示, 1 kb启动子可能不是决定Prss37基因组织特异性和时空特异性的关键区域。

3　讨论

课题组以往的研究证实了Prss37基因的缺失会导致雄性不育，且与精子在输卵管中的迁移和精卵结合密切相关，并在不明原因男性不育病人的精子中发现了该基因的表达下降（相关内容将在另一篇文章中发表），表明该基因的表达与人类男性不育相关，有临床应用价值。

小鼠Prss37基因特异性地表达于睾丸组织中，且在小鼠出生后23 d开始转录，28 日龄开始可检测到的蛋白的表达［8］，提示Prss37基因的转录受到严格的调控。课题组通过5’RACE技术确定了该基因的转录起始位点，为寻找体外研究该基因的转录调控的细胞系, 对两个小鼠生精细胞系GC-1 spg 和GC-2 spd中该基因的内源性表达进行检测，均未发现该基因的表达，该基因表达的特殊性致使无法在体外开展启动子活性的研究。为此，课题组分别选取不同长度（1 kb、2 kb、4 kb）的启动子序列构建带有荧光素酶基因的载体，并通过受精卵雄原核显微注射构建转基因小鼠，然而在转基因小鼠的后续繁育及表达检测过程中仅1 kb启动子的转基因小鼠（49系）检测到荧光素酶基因的表达，但未能实现睾丸特异性表达； 同时在49系小鼠传代过程中,发现16只F1代小鼠中有11只为转基因阳性鼠, 明显高于后代中应有50%阳性鼠的理论值（8只）, 且在F2代转基因阳性小鼠中也有荧光素酶基因不表达的情况，推测该系小鼠的转基因片段存在多位点插入的可能, 详细的分子机制有待进一步研究。现有的研究结果［12］已经证明, 雄原核显微注射获得的转基因小鼠存在外源片段随机整合、多拷贝串联、多位点整合的可能性，位置效应直接影响外源基因的表达，故上述实验结果并不能说明所获得的启动子序列不能实现外源基因表达的组织和时空特异性，课题组将通过同源重组技术将上述转基因片段敲入小鼠rosa26基因位点, 进一步验证启动子片段的活性。

该研究获得的转基因小鼠模型中荧光素酶基因的表达未能完全模拟体内Prss37基因的表达，为此课题组将通过同源重组技术将荧光素酶基因定点插入小鼠Prss37基因启动子下游，以期获得治疗男性不育药物和节育药物筛选的理想动物模型。

图5　荧光素酶基因表达时空特异性分析

［1］ Ikawa M, Inoue N, Benham AM, et al. Fertilization： A sperm’s journey to and interaction with the oocyte［J］. J Clin Investigat, 2010, 120（4）：984-994.

［2］ Muro Y, Okabe M.Mechanisms of fertilization-a view from the study of gene-manipulated mice［J］. J Androl, 2011, 32（3）：218-225.

［3］ Rawlings ND, Barrett AJ.Evolutionary families of peptidases［J］. Biochem, J, 1993, 290（Pt1）：205-218.

［4］ Kawano N, Kang W, Yamashita M,et al. Mice lacking twosperm serine proteases,ACR and PRSS21,are subfertile,but the mutant sperm are infertile in vitro［J］. Biol Reprod, 2010, 83（3）：359-369.

［5］ Honda A, Yamagata K, Sugiura S, et al. A mouse serine protease TESP5 is selectively included into lipid rafts of sperm membrane presumably as glycosylphosphatidylinositol-anchored protein［J］.J Biol Chem, 2002, 277（19）：16976-16984.

［6］ Gyamera-Acheampong, C, Tantibhedhyangkul J, Weerachatyanukul W.et al,Sperm from mice genetically deficient for the PCSK4 proteinase exhibit accelerated capacitation, precocious acrosome reaction,reduced binding to egg zona pellucida,and impaired fertilizing ability［J］.Biol Reprod, 2006, 74（4）：666-673.

［7］ Gyamera-Acheampong C, Mbikay M. Proprotein convertase subtilisin/kexin type 4 in mammalian fertility： a review［J］. Hum Reprod Update, 2009, 15（2）：237-247.

［8］ Shen C, Kuang Y, Liu J, et al. Prss37 is required for male fertility in the mouse［J］.Biol Reprod, 2013, 88（5）：1-11.

［9］ Contag PR, Olomu IN, Stevenson DK, et al.Bioluminescent indicators in living mammals［J］. Nat Med, 1998, 4（2）：245-247.

［10］ Zhang W, Contag PR, Madan A, et al.Bioluminescence for biological sensing in living mammals［J］.Adv Exp Med Biol, 1999, 471：775-784.

［11］ Li L, Fei Z, Ren J, et al. Functional imaging of interleukin 1 beta expression in inflammatory process using bioluminescence imaging in transgenic mice［J］. BMC Immunol, 2008, 9：49.

［12］ Michalova K, Bucchini D, Ripoche MA, et al.Chromosome localization of the human insulin gene in transgenic mouse lines［J］. Hum Genet, 1988, 80（3）：247-252.

Identification of Mouse Prss37 Transcription Initiation Site and Preliminary Analysis of Its Transcription Regulation

WANG Jin-jin1, KUANG Fang-zhe1, ZHUANG Hua1, LU Cui-jie3, KUANG Ying2
（1. Shanghai Biomodel Organism Science & Technology Development Company， Shanghai 201203， China；2. Shanghai Research Center for Biomodel Organisms， Shanghai 201203， China；3. School of Life Science and Technology， Tongji University， Shanghai 200092， China）

ObjectiveTo determine the transcription initiation site of mouse Prss37 gene, and verify the tissue specificity of the promoter in vivo using transgenic technology. MethodsThe transcription initiation site was identified by 5' rapid amplification of cDNA ends （5' RACE ） used to analyze the mRNA of testis from C57BL/6J mice . The plasmids including different lengths of promoter （1kb, 4kb, and 6kb）and luciferase gene were constructed. Then, these plasmids were injected into male pronucleus by microinjection technique to obtain luciferase positive transgenic mice. ResultsThe transcription start site of Prss37 gene was located at the 40bp site upstream of the predicted site reported in GeneBankTM （NM_026317.2）. Moreover, three kinds of transgenic mice were successfully established, but the expression of luciferase gene was only detectable in transgenic mice driven by 1kb promoter. The higher expression level of luciferase was found in brain, testis and epididymis tissues. ConclusionThe transgenic mice expressing luciferase in testis and epididymis tissues were successfully established, which laid a foundation for further research on the transcriptional regulation of Prss37 gene.

Prss37 gene； Transcription； Transgenic mice； Luciferase gene

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0093-08

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.003

2015-12-08

上海市科委项目资助（13140901400, 14140900400, 13DZ2280600）

王津津（1983-）, 博士, 女, 助理研究员。E-mail： jinjin.wang@shmo.com.cn

匡颖（1965-）, 女, 硕士, 研究员。E-mail： ying.kuang@shmo.com.cn