微小RNA簇miR-302s条件性基因打靶小鼠的制备和鉴定

余　飞, 钱丽萍, 丁利军（南京大学医学院附属鼓楼医院. 动物实验中心, . 生殖医学中心, 南京0008）

微小RNA簇miR-302s条件性基因打靶小鼠的制备和鉴定

余飞1, 钱丽萍1, 丁利军2
（南京大学医学院附属鼓楼医院1. 动物实验中心, 2. 生殖医学中心, 南京210008）

目的制备微小RNA簇miR-302s条件性基因打靶小鼠。方法构建miR-302s打靶载体,通过电穿孔的方法转染胚胎干细胞（ES细胞），用正负筛选法筛选阳性ES细胞并进行PCR鉴定和Southern分析。利用显微注射技术将正确同源重组的ES细胞注射至B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J小鼠囊胚腔内，注射后的囊胚植入受体小鼠子宫。将得到的嵌合体小鼠与野生型雌鼠交配获得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠。结果获得嵌合体小鼠11只, 其中4只嵌合雄鼠嵌合率＞50%。利用嵌合体小鼠进行繁育交配，得到miR-302s基因打靶杂合子小鼠11只。结论成功建立miR-302s条件性基因打靶小鼠模型，为进一步研究miR-302s基因功能打下基础。

miR-302s； 条件性基因打靶小鼠； 胚胎干细胞； 同源重组

MicroRNAs （miRNAs）是人类新发现的一类长约22 nt的非编码单链小RNA分子，通过碱基配对原则与靶mRNA的3'UTR区结合，诱发转录后抑制与降解, 从而调控靶基因的表达［1］。miR-302家族有miR-302a, 302b, 302c, 302d四个高度同源的成员，合称为miR-302s。小鼠miR-302s位于3号染色体内串联排列, 调节大约445个基因, 且各个miRNA所调节的靶基因基本相同, 这些基因的功能涉及早期胚胎发育相关的信号或影响干细胞分化［2-4］。miR-302s在调节基因组DNA表观遗传，维持干细胞特性方面具有重要作用［5,6］。本实验尝试制备miR-302s条件性基因打靶小鼠模型，为进一步研究miR-302s维持胚胎发育和干细胞分化的机制打下基础。

1　材料与方法

1.1材料

基因打靶所用胚胎干细胞： 源自B6/BLU雄性小鼠（毛色为黑色）, 南京大学模式动物研究所提供, 辐照后MEF为饲养层, 小鼠胚胎干细胞（ES细胞）培养基配制参考文献［7］。注射用囊胚： B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J雌鼠（毛色为白色）通过超数排卵、自然受孕和胚胎体内发育至囊胚阶段, 用于显微注射。胚胎操作液为M2, 胚胎培养液为M16, 购自美国Sigma公司。假孕受体小鼠为封闭群ICR小鼠。小鼠均购于南京大学模式动物研究所［SCXK（苏）2015-0001］，饲养于南京大学模式动物研究所屏障环境下［SYXK（苏）2015-0001］。生物试剂： 各种限制性内切酶、T4DNA 连接酶、Taq酶等购自TaKaRa 及NEB公司, DNA marker（1 kb ladder） 购自晶美生物工程公司, 质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司。细胞培养所需试剂为Invitrogen公司产品。引物合成和测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2方法

1.2.1miR-302s条件性基因打靶载体的构建和鉴定以含有neo-tk基因的pLoxPneo载体为基本骨架, 用涵盖8个miRNAs的mir-302基因簇 （miR-302b*-b-c*-c-a*-a-d-367）片段为构建载体的重组DNA片段，引入LoxP，建立miR-302s的条件性打靶载体（图1）。终载体构建完成后经PCR、酶切等方法进行验证。PCR引物为miR-302s-loxptF： 5'-CCTCCTTTACTTTAACATGGAGG-3'； miR-302s-loxptR： 5'-CTCTACTGAGGAGGAGAAGGAGA-3'。PCR产物大小379 bp。图2为最终载体图谱, 并对载体进行测序。

图1　miR-302s 基因打靶小鼠打靶载体构建策略

图2　miR-302s 基因打靶载体质粒图谱

1.2.2miR-302s条件性基因打靶载体的线性化将测序正确的100 μg miR-302s条件性基因打靶载体质粒NotⅠ（酶用量： 300 IU） 酶切线性化，酶切体积300 μL，37 ℃消化过夜。等体积苯酚-三氯甲烷、三氯甲烷处理后，无水乙醇沉淀，100 μL无菌PBS重悬备用。

1.2.3ES细胞打靶及筛选基因打靶所用胚胎干细胞为来源于B6/BLU雄性小鼠的ES细胞。使用线性化的miR-302s基因打靶载体DNA 30 μg进行电穿孔转染，电穿孔条件为电压240 V，电容500 μF；实际通电时间9.6 ms，实际电压256 V。打靶后克隆用300 μg /mL G418 和 2 μmol /L羟甲基无环鸟苷（Gancyclovir）筛选8 d后获得双药抗性ES细胞。克隆后抽提基因组DNA, 通过PCR、Southern杂交等方法鉴定2条同源臂并测序，确定成功同源重组的ES细胞克隆，以构建的重组载体作为阳性对照。跨5'或3'臂和插入片段的长链PCR鉴定引物如下。位于同源臂5'臂PCR引物miR-302s-5F1：5'-GTCAGAACCACTGAAATTTTG-3', Neo-5R：5'-GGCTGGACGTAAACTCCTC-3', 目的片段为5.4 kb, PCR 反应条件为： 95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s, 64 ℃ 390 s, 40 个循环； 64 ℃ 10 min。位于同源臂3' 臂PCR引物为 ES-2F4： GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG，miR-302s-3R2： CTCTGCTTTAGATCTAGTGG, 目的片段为5.4 kb，PCR 反应条件为： 95 ℃ 5 min； 95 ℃30 s，64 ℃ 390 s，40个循环； 64 ℃ 10 min。两套Southern探针（分别位于5'臂外侧和3'臂外侧）引物，miR-302s-P5F： 5'-CTCAGTCATACTCAGAGAAACGGAT-3'，miR-302s-P5R： 5'-AAGGGTCTCACACCATTTAGTCT-3', 产物长度447 bp, 阳性重组ES细胞的目的条带7.5 kb； mir-302s-P3F： 5'-GGAACAAGTTACAGACCAAACAGAA-3', mir-302s-P3R： 5'-CACAGAAATGAGAAAA-CTTCCAGAC-3', 产物长度414 bp, 阳性重组ES细胞的目的条带5.0 kb。鉴定完毕后选择状态良好的阳性细胞留作受体小鼠（毛色呈现白色）囊胚腔内注射。

1.2.4阳性ES细胞显微注射取4周龄B6（Cg）-Tyr ＜sup＞c-2J＜/sup＞/J雌鼠，48 h间隔注射孕马血清促性腺激素（PMSG） 10 IU 和人绒毛膜促性腺激素（hCG） 10 IU促排卵。与B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/ sup＞/J雄鼠合笼后次日早晨检查阴栓，记为0.5 dpc （day post coitum）。2.5 dpc取胚胎，培养过夜后用于显微注射。每个囊胚腔注射12～15个ES细胞。显微注射后的囊胚培养2 h后移植。

1.2.5基因打靶小鼠的获得和鉴定嵌合体小鼠出生后，将嵌合率＞50%的成熟雄性小鼠与野生型雌性小鼠进行交配，后代小鼠经提取尾基因组DNA进行PCR鉴定，得到重组杂合子小鼠。

PCR引物为miR-302s-loxptF（P1）： 5'-CCTCCTTTACTTTAACATGGAGG-3'； miR-302s-loxptR（P2）：5'-CTCTACTGAGGAGGAGAAGGAGA-3', 片段长度为： wt/wt=337 bp, wt/fln=337 bp/379 bp, fln/fln=379 bp；miR-302s-frttF（P3）： 5'-AGGCATATGTTTACA-TTATTTG-3'； Neo-5R（P4）： 5'-GGCTGGACGTAAACTCCTC-3', 片段长度为： wt/wt=0, wt/fln=0/287 bp, fln/fln=287 bp。miR-302s-frttR（P5）： 5'-AGCTGTTTGAAGATACATCTAC； ZMK-2F4（P6）： 5'-GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG-3', 片段长度为： wt/wt=0, wt/fln=0/437 bp, fln/fln=437 bp。

每只小鼠均用3套引物检测, 反应条件为： 95 ℃30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 40 个循环； 72 ℃ 5 min。

图3　miR-302s打靶载体的PCR验证

2　结果

2.1miR-302s条件性基因打靶载体鉴定

构建的miR-302s打靶载体质粒经PCR鉴定结果如图3所示，PCR产物长度379 bp。以31#基因打靶载体质粒为模板，经ApaLⅠ、ScaⅠ酶切，可以释放出阳性片段miR-302s，鉴定结果如图4。

图4　miR-302s条件性基因打靶载体质粒DNA 的ApaL I ScaI酶切鉴定

2.2阳性胚胎干细胞的鉴定

电穿孔转染后得到药物抗性ES细胞克隆共93个，经PCR鉴定，其中10个ES细胞克隆（C4, F4, G4, H4, A5, F5, G6, D8, B9, E10）发生双臂同源重组（图5、6）。

图5　打靶载体电穿孔转染ES细胞后5’臂PCR结果

进一步抽提ES细胞DNA5'臂经Bgll1酶切、3'臂经EcoRV酶切，经过Southern-blot分析，确定其中6个ES克隆（G4，H4，A5，F5，G6和B9）为阳性（图7）。

2.3基因打靶小鼠的鉴定

取筛选出的6个ES阳性细胞克隆中的2个（G4、F5）进行显微注射, 共注射158枚胚胎, 存活140枚, 注射后的囊胚移植8只ICR受体。受体妊娠7只, 共出生存活小鼠34只, 嵌合体小鼠11只, 其中4只嵌合雄鼠嵌合率＞50%。利用嵌合体小鼠进行繁育交配, 已经获得miR-302s-loxp重组杂合子小鼠11只（4#, 6#, 9#, 10#, 11#, 14#, 15#, 16#, 30#, 31#,32#），毛色为黑色，PCR鉴定结果如图8。

图6　打靶载体电转ES细胞后3’臂PCR结果

图7　ES细胞DNA的Southern分析

图8　miR-302s基因打靶小鼠PCR检测

3　讨论

miRNAs广泛分布于真核细胞内。miRNAs通过与靶基因互补位点配对结合，在转录后水平负性调控靶基因的表达，参与生长发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等生命过程。Lin等［8,9］研究表明，miR-302s高表达于人ES细胞，随细胞的分化其含量迅速减少, miR-302s是维持ES细胞自我更新和多潜能性的重要因子。当人肿瘤细胞转入miR-302s（转入后为mirPS细胞）, mirPS细胞不仅表达ES细胞的表面标志物如Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4、Sox2和Nanog等，而且基因组高度去甲基化。最近研究［10, 11］显示，利用miR-302b转染人成纤维细胞可以重编程为诱导的多能干细胞（iPSCs），提示其在维持干细胞全能性中的重要作用。本实验室预研究表明，miR-302s可能抑制肿瘤细胞子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1-B细胞的增殖和迁移。此外，将Ishikawa细胞移植至免疫缺陷小鼠显示miR-302s可抑制肿瘤生长［12］。作者近期的研究表明，miR-302s可能参与早期胚胎基因组的低甲基化水平的维持（未发表资料），但其调节早期胚胎发育表观遗传的机制尚不清楚。

基因敲除小鼠是研究基因功能的重要动物模型，为了更好地研究miR-302s的功能和作用机制，本研究制备了miR-302s条件性基因打靶小鼠，为进一步研究该基因提供了良好的平台。本研究中重组载体的构建策略是将loxp位点插入到miR-302d和miR-367之间（这段距离为43 bp）的位置，并导入neo基因作为正筛选基因。通过电穿孔转染和正负筛选得到阳性ES细胞并经显微注射到B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J小鼠的囊胚中，再移植到假孕受体小鼠子宫后得到嵌合体小鼠。嵌合体小鼠与野生型小鼠交配获得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠。获得的miR-302s-LoxP基因打靶小鼠可以与各种Cre小鼠交配，获得在不同发育阶段、不同组织部位miR-302s缺失的条件性基因敲除小鼠。

在获得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠后，作者已尝试将其与卵母细胞特异表达的Zp3-Cre小鼠交配以获得miR-302s基因敲除小鼠, 但繁育实验显示获得的阳性纯合子小鼠在胚胎种植后不久即退化或出生后因脑积水而死亡（未发表资料）, 提示miR-302s在胚胎植入前后的发育过程和脑发育中可能具有重要作用，有待进一步研究。

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Generation and Identification of miR-302s Conditional Gene Targeting Mice

YU Fei1, QIAN Li-ping1, DING Li-jun2
（1. Experimental Animal Center； 2. Reproductive Medicine Center， Nangjing Drum Tower Hospital The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School， Nanjing 210008， China）

ObjectiveTo generate microRNA miR-302s gene targeting mice. MethodsThe conditional gene targeting vector were generated by molecular cloning, and then the electroporation of embryonic stem （ES） cells were carried out. The targeted ES cells were screened by positive-negative selection and identified by PCR and Southern blot, and then the correct targeted ES cells were microinjected into blastula of B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J mice. Chimerical mice were generated after transplantation of the injected blastula into the host mice, and the miR-302s-LoxP gene recombinat mice were obtained after breeding. ResultsEleven miR-302s chimeric mice were obtained including four male chimeras with a higher than 50% chimeric ratio. Eleven miR-302s heterozygous gene recombinat mice were generated after outbred and inbred. ConclusionThe miR-302s conditional gene targeting mice were successfully obtained. This animal model provided the foundation for further study of miR-302s in vivo.

miR-302s； Conditional gene targeting mice； Embryonic stem （ES） cell；Homologous recombination

R-33 Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0087-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.002

2015-10-22

国家自然科学基金项目（30900847）, 中央高校苗圃项目 （20620140707）, 南京市卫生杰出青年人才项目（JQ2014004）

余飞（1982-）, 女, 硕士, 助理研究员, 主要研究方向： 实验动物学。E-mail： yufei0802@yeah.net

丁利军（1981-）, 男, 博士, 副研究员, 主要研究方向：生殖医学。E-mail： xmljding@163.com