响应面法优化鱼尾鳍抗氧化肽酶解工艺

苏现波　王更先

(邯郸学院，河北 邯郸 056005)



响应面法优化鱼尾鳍抗氧化肽酶解工艺

苏现波王更先

(邯郸学院，河北 邯郸 056005)

对酶解法制备鱼尾鳍抗氧化肽的最佳工艺进行探讨，以期为丰富鱼尾鳍应用领域，开发高附加值水产品提供理论依据。以羟自由基清除率为评价指标，通过响应面分析得到最佳酶解工艺为：底物浓度15%(w/v)，酶解pH=8.403，温度54.02℃，加酶量0.6%(w/w)，酶解时间3 h。在此最优条件下制备的鱼尾鳍抗氧化肽产物对羟自由基的清除率为82.09%，与理论值相比相对误差为1.38%。同时测得此酶解条件下，鱼尾鳍多肽得率为31.68%。

鱼尾鳍；抗氧化肽；酶解；羟自由基；响应面法

我国是世界上主要的渔业生产国，但鱼类加工会产生大量的下脚料，包括鱼头、鱼骨、内脏和鱼尾鳍等，约占原料鱼的40%～55%[1]。据统计，2003年我国鱼类加工的废弃物总量就达到200万吨以上。目前，发达国家的水产品加工率在80%以上，而我国的水产品加工率不足30%[2]。这些下脚料中不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和微量元素，还含有多种活性物质。因此合理开发利用这些低值水产品下脚料具有一定的经济效益和社会意义。

鱼尾鳍中粗蛋白含量高达40%左右[3]，可作为优质水产蛋白的来源。目前工业上只是将鱼尾鳍加工成饲料鱼粉，或是作为废料处理，造成资源的极大浪费和环境污染。鱼类多肽不仅具有鱼类蛋白质的优点，在功能特性与生物活性方面又得到极大的改善，具有良好的溶解性、热稳定性等理化性质以及易消化吸收、抗氧化活性、降血压活性等生理功能[4]，近年来得到国内外学者的研究和推崇[5～7]。因此本文采用酶解方法制备鱼尾鳍抗氧肽，利用单因素实验和响应面分析优化得到最佳酶解工艺，最终获得高得率和抗氧化性的鱼尾鳍酶解产物，从而为鱼尾鳍的开发利用提供理论依据，减少环境污染并提高水产品加工的附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼尾鳍(邯郸市菜市场)；碱性蛋白酶(BR 南宁东恒华道生物科技有限责任公司)；牛血清白蛋白(BR 上海如吉生物科技有限发展公司)；Tris试剂(GR Sigma)；福林酚试剂(BR 国药集团)；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、硼砂、硫酸铜、酒石酸钠、硫酸钠、盐酸、抗坏血酸、邻苯三酚、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢(AR 国药集团)。

1.2 仪器与设备

JA3003B型电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；SHZ-B水浴恒温震荡器(上海将任实验设备有限公司)；HH-2数显恒温水浴锅(上海将任实验设备有限公司)；PHS-25数显酸度计(杭州雷磁分析仪器厂)；JYL-C022型九阳料理机(九阳股份有限公司)；5810型台式高速离心机(德国艾本德股份公司)；FD-1A-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；722可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

将鱼尾鳍剔除鱼肉洗净后冷冻干燥，打成粉备用。

1.3.2 鱼尾鳍中各组分的含量分析

蛋白质测定：GB/T5009.5—2010 凯氏定氮法；灰分测定：GB/T5009.4-2010 灼烧法；水分测定：GB/T5009.3-2010 干燥法；脂肪测定：氯仿-甲醇法[8]；总糖测定：蒽酮比色法[9]。

1.3.3 鱼尾鳍抗氧化肽的制备

称取15 g鱼尾鳍粉末，加入250 mL具塞三角瓶中，加入一定量去离子水，使其底物浓度为15%(w/v)，搅拌均匀，调节溶液pH=9.0，60℃下水浴震荡30 min后加入0.6%碱性蛋白酶开始水解，待酶解3 h后快速于99℃灭活10 min，冷却后9800 r/min离心28 min，去除上清液中微量油脂及底部沉淀，收集中间部位清液备用。

1.3.4 碱性蛋白酶单因素实验

按照1.3.3鱼尾鳍抗氧化肽制备方法，分别考察底物浓度、pH、温度、加酶量和酶解时间五种因素[10]对鱼尾鳍抗氧化肽多肽得率和抗氧化活性的影响。

各因素水平分别为：底物浓度：5%、10%、15%、20%、25%；pH：7.0、8.0、9.0、10.0；酶解温度：40℃、50℃、60℃、70℃；加酶量: 0.2%、0.6%、1.0%、1.4%(w/w)；酶解时间：2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。

1.3.5 多肽得率的测定

牛血清白蛋白对照品溶液：精确称量2.5 mg牛血清白蛋白，用蒸馏水定容于25 mL容量瓶。

标准曲线的制备：精密移取对照品溶液0.0 mL，0.5 mL，1 mL，1.5 mL，2 mL，分别置于具塞试管中，各加水至2.0 mL。再分别加入5 mL试剂C(VA液:VB液=1:50；A液为0.5 g硫酸铜和1.0 g酒石酸钠溶于100 mL蒸馏水中，B液为20.0 g碳酸钠和4.0 gNaOH溶解于1 L蒸馏水)，混匀于室温下放置10 min后，各加入0.5 mL试剂D(Folin-酚试剂)，立即混匀，室温下放置30 min，然后于750 nm处测定其吸光度值。同时以0号管为空白，对照品溶液浓度为横坐标，其相对应的吸光度为纵坐标，计算线性回归方程。

样品的测定：量取1.0 mL酶解液，依标准曲线的制备方法，测出酶解液在750 nm处的吸光度值。并计算多肽得率(%)。

式中：c为由标准曲线计算得到的多肽提取液的质量浓度(mg/mL);V为多肽提取液的体积(mL)；m为样品粉质量(mg)。

1.3.6 抗氧化性的测定

方法测定对羟自由基的清除效率[11]。

2 结果与分析

2.1 鱼尾鳍中各基本组分的分析结果

多数鱼类的蛋白质含量可达18%～20%，高于肉、禽、蛋、奶的蛋白质含量[12]。由表1可以看出，该鱼尾鳍主要成分为蛋白质，含量为18.96%，与鱼肉蛋白质含量相近。经冷冻干燥后，鱼尾鳍粉末中蛋白质含量则接近47%。

表1 鱼尾鳍中各基本组成成分(%)

2.2 单因素实验

2.2.1 底物浓度

如图1所示，随着底物浓度的增加，多肽得率和羟自由基清除率都表现为先增加后降低的趋势。当底物浓度较低时，酶与底物接触几率小，酶解程度较弱，导致其产生的多肽较少。随着底物浓度的增加，多肽得率也随之增加。当底物浓度为10%时，其多肽得率达到最高。若底物浓度继续增加，多肽得率反而下降，其原因是该体系底物浓度增加导致溶液黏度提高，因此降低体系中底物和蛋白酶的反应接触能力，从而抑制酶解作用。从图1还可得知，当底物浓度为15%时，羟自由基清除率达到最大值。

2.2.2 pH

pH通过影响酶的稳定性、酶与底物的结合以及酶催化底物转变成产物，从而影响酶的催化效果[13]，因此pH是酶解反应的重要因素之一。结果如图2所示。可以看出，在pH7.0～8.0范围，多肽得率和羟自由基清除率随pH上升而增加。在超过pH 9后则呈现下降趋势。考虑到实验所用酶为碱性蛋白酶，故选择pH范围8.0～10.0。

2.2.3 温度

温度对酶的稳定性及反应速率皆有一定影响。酶解温度过高则会破坏蛋白酶特定空间构象，从而破坏蛋白酶活性中心，降低其活性；若酶解温度过低，则降低酶解体系内的分子运动，使底物和酶活性分子的碰撞几率降低[14]。酶解温度对多肽得率及羟自由基清除率的影响如图3所示。随着酶解温度升高，多肽得率和羟自由基消除率呈先升高后下降的趋势。在55℃～60℃时，多肽得率和羟自由基消除率较高。当温度高于60℃时，两者反而下降，可能是由于温度升高导致蛋白酶结构改变，活性降低。因此，在后续实验中，选择酶解温度为不高于60℃。

2.2.4 加酶量

由图4可知，随着加酶量的增加，多肽得率和羟自由基清除率逐渐增加。当加酶量高于0.6%时，加酶量对多肽得率和羟自由基清除率均不再有显著影响。说明当加酶量为0.6%时，酶分子与底物的结合已达到饱和。因此在酶解实验中，确定最佳加酶量为0.6%。

2.2.5 酶解时间

由图5可知，酶解前3h内，多肽得率和羟自由基清除率随酶解时间增加逐步上升。酶解时间长于3h时，酶解时间不再对多肽得率有显著影响，而羟自由基清除率降低，可能是随着酶解时间延长，部分具有抗氧化活性的多肽被继续水解导致抗氧化性降低。因此，本实验确定碱性蛋白酶酶解鱼尾鳍的较优反应时间为3h。

2.3 响应面

根据以上单因素实验结果，确定使用碱性蛋白酶酶解鱼尾鳍的基本工艺参数，下一步以抗氧化活性即羟自由基的清除率为评价指标，利用响应面分析法对酶解反应进行优化。

在单因素实验的分析结果基础上，采用三因素三水平的Box-Behnken响应面的设计方法，选择底物浓度、酶解pH以及温度这三个相对来说影响较大的因素进行响应面试验，试验因素水平的设计见表2[15,16]。

表2 Box-Behnken响应面试验设计因素水平

2.3.1 响应面分析设计及结果

以底物浓度、pH以及反应温度为自变量的三因素三水平试验共17组，经软件Design Expert 8.05设计Box-Behnken响应面试验设计因素水平，具体试验设计及结果如表3和表4所示。

表3 响应面试验设计及结果

表4 回归模型的方差分析

通过软件对所得数据进行回归分析，得到回归方程为：

Y=68.80+3.90A-4.47B+3.10C-9.56AB-2.39BC+5.73A2-5.63C2。

由表4可知，该模型的P=0.0117<0.05，失拟性在α=0.05水平上不显著(P=0.2682>0.05)，表明该模型差异显著，能正确反映鱼尾鳍酶解过程中底物浓度、酶解pH以及反应温度之间的关系。

2.3.2 各因素交互作用分析

各因素对羟自由基清除率影响的响应曲面图如图6～8所示。由图可看出，随pH(B)和反应温度(C)的增加，羟自由基的清除率呈现先增加后降低的趋势。从图6可知，在固定的酶解pH下，随着底物浓度的增大，羟自由基的清除率先缓慢提高后逐渐减小；而在反应温度一定时，羟自由基的清除率随底物浓度的增加而增加(如图7所示)。比较三个因素的两两交互作用图，A(底物浓度)与B(酶解pH)的交互作用对羟自由基清除率的影响较大，表现为在选定的取值区间内曲面响应值变化大，这与回归模型方差分析中的AB项P<0.01结果一致。

2.3.3 回归模型的验证试验

经软件Design Expert 8.05优化后，分析得到最佳的实验参数为：底物浓度为15%(w/v)，酶解为pH=8.403，反应温度为54.02℃。对最佳方案进行验证，测得羟自由基清除率为82.09%，与理论预测的最大值83.2432%相比，相对误差为1.38%，说明该模型可较好的预测碱性蛋白酶酶解鱼尾鳍的反应条件和羟自由基清除率的关系，同时也证明响应面法优化碱性蛋白酶酶解鱼尾鳍制备抗氧化肽工艺参数的科学性和可行性，此酶解条件下测得多肽得率为31.68%。

3 结论

选用碱性蛋白酶对鱼尾鳍进行酶解，以多肽得率和对羟自由基的清除率为指标，采用单因素实验和响应面分析优化对酶解鱼尾鳍的主要影响因素底物浓度、pH、温度、加酶量和酶解时间进行优化，并建立了基于鱼尾鳍抗氧化肽酶解条件的优化模型。试验结果表明：底物浓度15%，pH=8.403，反应温度54.02℃，加酶量0.6%，酶解时间3h，酶解产物的抗氧化性最佳，对羟自由基清除率为82.09%，与预测值相比相对误差为1.38%，表明该模型可较好的预测碱性蛋白酶酶解鱼尾鳍的反应条件和羟自由基清除率的关系。该研究为鱼尾鳍的开发利用提供理论依据，可减少环境污染并提高水产品加工的附加值。

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[责任编校：张彩红]

2016-03-22

邯郸市科技局科学技术研究与发展计划项目(1422104057-4)。

苏现波，男，河北邯郸人，邯郸学院讲师。

TS254.9

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1009-5462(2016)01-0053-07