17β-雌二醇对大鼠海马神经元钙离子水平的快速影响

沈巧巧，　徐晓虹，　戴玉华，　胡一中

(浙江师范大学 化学与生命科学学院 生态研究所,浙江 金华　321004)



17β-雌二醇对大鼠海马神经元钙离子水平的快速影响

沈巧巧，徐晓虹，戴玉华，胡一中

(浙江师范大学 化学与生命科学学院 生态研究所,浙江 金华321004)

探讨了17β-雌二醇(17β-E2)对体外培养大鼠海马神经元细胞内钙离子水平([Ca2+]i)的快速影响及其可能的机制.大鼠海马神经元体外培养8～10 d，用Fluo 4-AM钙离子荧光探针负载胞内Ca2+，用激光共聚焦显微镜动态检测了17β-E2对谷氨酸诱导的神经元内Ca2+荧光强度的影响.结果显示：17β-E2(10 nmol·L-1)处理30 min，对正常状态下神经元的[Ca2+]i无显著影响,但可快速促进谷氨酸诱导的[Ca2+]i增加(与对照组相比，P<0.001)，雌激素受体阻断剂ICI182780(10 μmol·L-1)预处理可阻断17β-E2的这一促进作用；胞外信号调节激酶(ERKs)抑制剂U0126(10 μmol·L-1)单独处理神经元，可极显著抑制谷氨酸诱导的[Ca2+]i增加(P<0.001)，但这一作用可以被17β-E2部分逆转.研究结果提示，ERKs信号通路可能参与谷氨酸诱导的神经元[Ca2+]i增加，17β-E2可能经雌激素受体介导的ERKs信号通路快速促进谷氨酸诱导的神经元[Ca2+]i增加.

17β-雌二醇；钙离子；海马神经元；胞外信号调节激酶

内源性雌激素不仅是调控生殖系统的重要激素，也是参与脑的发育及其功能活动的激素.在人和啮齿类动物的发育乃至整个生命过程中，脑对雌激素都非常敏感，雌激素在神经发生、神经保护及突触可塑性等方面发挥着重要作用[1].有研究发现，大鼠海马脑区神经元树突棘密度随动情周期雌激素水平的波动而变化，处于动情前期(雌激素水平较高)的雌鼠海马神经元树突棘密度增加[2].体外研究发现，17β-雌二醇(17β-E2)能快速增加海马CA1区树突棘密度，快速促进高频刺激诱导的长时程增强(long-term potentiation，LTP)效应[3].表明17β-E2的许多生物学效应不仅由经典的核雌激素受体(ERs)介导，而且常常表现出快速的非基因效应.LTP是突触传递功能可塑性的重要表现形式，是学习与记忆的分子基础[4].在海马CA3区，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体激活引发钙离子通道打开是LTP产生的触发因素，胞内钙动力对LTP诱导和胞内一系列信号传递是不可缺少的.有研究发现，少量Ca2+增加可以引起长时程抑制(long-term depression,LTD)，大量Ca2+增加则引起LTP[5].因此，17β-E2对突触可塑性的调节作用可能与胞内Ca2+增加有关[6].也有研究发现，17β-E2(25 nmol·L-1)能够引起血细胞内钙离子水平([Ca2+]i)快速上升，并伴随p-ERKs/MAPK的瞬时升高[7].文献[8]发现，20～50 nmol·L-1的17β-E2在5 min内即可引起大鼠肾脏细胞[Ca2+]i上升.但目前尚未见17β-E2对神经细胞[Ca2+]i作用的相关报道，对其作用机制更知之甚少.

1　实验材料和方法

1.1大鼠海马神经元离体培养

清洁级新生24 h内的健康SD大鼠乳鼠，购于浙江省医学科学院实验动物中心.

将实验动物断头取脑，剥离出海马组织，在DMEM高糖培养基(Gibco)中剪碎后加入0.25%的胰蛋白酶(Amresco)，置于37 ℃的CO2培养箱中消化30 min后终止消化，低速离心1 min，用胶头滴管反复轻轻吹打海马组织制成细胞悬液.用含10%胎牛血清(杭州四季青)和90%DMEM的高糖培养基稀释细胞并接种于预先涂有0.1 g·L-1多聚赖氨酸(Sigma)的小玻片上，细胞密度大约为1×104cm-2，每个直径为35 mm的培养皿中10个小玻片，培养于37 ℃的CO2培养箱中，4 h左右细胞贴壁后吸去种植液，每个培养皿加2 mL培养液(含2%B27添加剂(InvirtrogenTM)，3 g·L-1L-谷氨酰胺(Amresco)和50 μg·L-1双抗的Neurobasl培养基(Gibco)).之后每隔3 d半量换液.

1.2Fluo 4-AM荧光探针标记

海马神经元培养至第8～10 d，吸去培养液，用Hank′s平衡盐溶液(HBSS)(8 g·L-1NaCl,0.126 g·L-1Na2HPO4·H2O,0.4 g·L-1KCl,0.06 g·L-1KH2PO4,0.098 g·L-1MgSO4,0.14 g·L-1CaCl2,0.35 g·L-1NaHCO3,1 g·L-1D-葡萄糖)洗涤细胞3次，加入Fluo 4-AM special pakcaging(Dojindo)工作液(终浓度为5 μmol·L-1)，溶液量以覆盖细胞为准.在37 ℃的CO2培养箱中孵育30 min，之后用HBSS洗涤细胞3次，以去除Fluo 4-AM工作液.

1.3药物处理和共聚焦检测

文献[9-10]报道，10 nmol·L-117β-E2接近内源性雌激素的生理作用.在Fluo 4-AM荧光探针标记后，用终浓度为10 nmol·L-1的17β-E2(Sigma)处理细胞，CO2培养箱37 ℃孵育30 min.为探讨17β-E2对[Ca2+]i的影响机制，先用终浓度为10 μmol·L-1的雌激素受体阻断剂ICI182780(Tocris)或ERK1/2抑制剂U0126(Cell Signaling)预处理海马神经元30 min，后加入10 nmol·L-117β-E2处理30 min，同时设置空白对照组和单独添加抑制剂组.用激光共聚焦显微镜检测细胞荧光强度，激发波长为494 nm，发射波长为516 nm.每个细胞隔10 s拍一张照片，拍5 min，共30张照片.60 s时加入终浓度为20 μmol·L-1的谷氨酸(Sigma)诱导神经元[Ca2+]i增加.每组检测50个细胞，分别来自6个独立培养皿.

1.4数据处理

2　结　果

2.117β-E2不影响大鼠海马神经元正常状态下的[Ca2+]i

激光共聚焦显微观测结果显示：正常状态下，神经元胞内荧光强度保持稳定，没有明显的变化(见图1(a))；17β-E2处理的神经元胞内荧光强度基础水平微弱增加(无统计学差异，P>0.05) 但仍然保持稳定水平(见图1(b)).表明正常状态下海马神经元 [Ca2+]i保持稳定，17β-E2不影响基础状态下的海马神经元[Ca2+]i.

2.2谷氨酸快速升高大鼠海马神经元[Ca2+]i

正常状态下海马神经元[Ca2+]i稳定，但当加入生理浓度(终浓度为20 μmol·L-1)谷氨酸(Glu)时，海马神经元胞内Ca2+荧光瞬时增强达60%(见图2(a))，并且在300 s内荧光强度基本保持不变，表明大鼠海马神经元对谷氨酸具有很高的敏感度(见图2(b)和(c)).因此，本实验以谷氨酸刺激海马神经细胞的Ca2+内流.

2.317β-E2促进谷氨酸诱导的大鼠海马神经元[Ca2+]i升高

17β-E2处理不改变基础状态下海马神经元胞内Ca2+荧光强度，但明显促进了谷氨酸诱导的胞内Ca2+荧光强度的增加(见图3(a)).与溶媒对照组相比，17β-E2处理组神经细胞在谷氨酸刺激后胞内Ca2+荧光强度增加到100%(P<0.001)(见图3(b)和(c))，表明17β-E2处理不改变基础状态下海马神经元[Ca2+]i的基础值，但可显著促进谷氨酸引起的[Ca2+]i升高.

2.4雌激素受体和ERK信号通路对大鼠海马神经元[Ca2+]i的影响

为了探讨17β-E2促进谷氨酸诱导[Ca2+]i升高的机制，本研究在17β-E2急性处理前先用雌激素受体阻断剂ICI182780预处理，结果发现，ICI182780单独处理对[Ca2+]i无明显的影响，但几乎完全抑制了17β-E2对谷氨酸诱导[Ca2+]i升高的促进作用(P<0.01).表明17β-E2经雌激素受体介导快速促进谷氨酸诱导的神经细胞[Ca2+]i升高.

接着，用ERK抑制剂U0126单独处理细胞，显著减少了谷氨酸诱导的[Ca2+]i升高(P<0.001).在17β-E2处理前用U0126预处理30 min，谷氨酸诱导的[Ca2+]i仍然显著低于对照组(P<0.05)，提示谷氨酸诱导[Ca2+]i升高需要激活ERKs信号通路.然而，当17β-E2预处理后再用U0126处理细胞，发现U0126对谷氨酸诱导的[Ca2+]i升高的抑制作用部分消除(见图4)，提示17β-E2可能通过激活ERKs信号通路促进谷氨酸诱导的神经细胞[Ca2+]i升高.

*表示P<0.05，***表示P<0.001，与谷氨酸诱导对照组(CON)相比；#表示P<0.05，与17β-E2组相比；$$$表示P<0.001，与ERKs抑制剂(U0126)组相比.,来自6个独立培养皿图4　雌激素受体阻断剂及ERKs抑制剂对谷氨酸诱导海马神经元[Ca2+]i的影响

3　讨　论

性激素不仅调控动物的生殖功能，对脑发育及其功能活动也起着重要的调节作用.雌激素能影响神经发生和脑源性神经营养因子的表达，诱导海马神经元分化，作用于与认知功能相关的海马神经元回路，影响海马神经元树突棘突触可塑性及其功能，进而影响学习与认知功能的形成与改善[11-12].在这些过程中，除了经典的基因调控机制外，雌激素还表现出快速的非基因效应.例如，雌激素可在2 h内快速增加成年大鼠海马CA1区神经元树突棘密度[13].

突触可塑性不仅表现在树突棘形态的变化，还表现在传递功能的可塑性，如长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)，它们均能选择性地修饰突触,被认为是学习记忆的神经基础[14].近来的研究发现，雌激素可在0.5～1.0 h内快速促进突触传递效能[4].Zamani等[15]也发现，雌激素能在数分内增加兴奋性突触后电位(EPSP)，促进LTP，从而增强海马神经元突触的传递功能.

谷氨酸是中枢神经系统中一种重要的兴奋性神经递质，而AMPA受体和NMDA受体是兴奋性突触中最重要的离子型谷氨酸受体，介导兴奋性突触反应[16].LTP是突触在接受反复刺激后诱导谷氨酸释放增加，通过与突触后AMPA受体和NMDA受体结合，促使突触后膜离子通道数量增加，最终使突触传递持续增强.[Ca2+]i升高为LTP诱导所必需，突触后[Ca2+]i达到一定的阈值，通过激活CaMKII和PKC等信号通路而产生LTP[17].本研究应用谷氨酸模拟突触前兴奋引起的谷氨酸释放，研究了17β-E2对谷氨酸释放诱导的神经元 [Ca2+]i的影响，结果发现：17β-E2对正常状态下海马神经元[Ca2+]i无显著影响；但可在30 min内快速促进谷氨酸诱导的神经元[Ca2+]i增加.与本研究结果相似，文献[18]也发现大鼠海马神经元内的雌激素能在数分内快速诱导[Ca2+]i升高.Shinsaku等[19]报道，17β-E2可增加NMDA受体介导的电流，导致突触后Ca2+水平上升而促进LTP.因此，本研究发现的17β-E2快速促进谷氨酸诱导的神经元[Ca2+]i增加，也许是17β-E2快速促进海马LTP形成的一个原因.

雌激素对谷氨酸诱导的神经元[Ca2+]i的快速升高效应是否由雌激素受体(ERα或ERβ)介导呢？早在1977年，Pietras等[20]就描述了雌激素的快速的非基因效应，发现质膜上有2种能对雌激素起快速反应的蛋白质.目前，越来越多的研究也证明，膜雌激素受体介导雌激素的非基因组效应，与雌激素的快速作用有关.Dewing等[21]的研究发现，在脑内，ERα和ERβ除细胞核分布外，胞浆和胞膜上也有部分分布.另外，文献[22]的研究表明，ERα和 ERβ的激动剂可以快速调节海马神经元的钙动力，但雌激素受体阻断剂阻断了这一作用.通过雌激素受体阻断剂(ICI182780)预处理，我们发现，雌激素受体阻断剂可以抑制17β-E2对谷氨酸诱导神经元[Ca2+]i升高的快速促进作用，提示膜雌激素受体介导了17β-E2的这一快速作用.

雌激素可以通过激活包括cAMP,MAPKs,PKC,PKA和PI-3K等多条信号通路快速调节细胞活动，其中MAPK激酶家族中的ERK信号通路被认为是联系各种胞外信号与膜受体、转录因子、基因调节中心的信号途径之一，参与学习记忆和突触可塑性.近年来的研究表明，ERK1/2信号转导通路与脑内LTP形成、学习记忆等认知功能密切相关，同时也是雌激素调节突触可塑性的主要途径[23-24].Bryant等[25]研究表明，皮下注射雌激素能在20 min内增强大鼠脑部分区域的ERK磷酸化.另外，有研究发现，在海马神经元中被雌激素激活的ERKs能转定位到核中[26].因此，笔者推测，雌激素调节神经元[Ca2+]i有可能通过ERK信号通路实现.本研究发现，ERK抑制剂U0126预处理可显著抑制谷氨酸诱导的神经元[Ca2+]i升高，17β-E2不能逆转U0126预处理后神经元[Ca2+]i对谷氨酸响应的抑制作用，但17β-E2预处理却能部分拮抗U0126对谷氨酸诱导神经元[Ca2+]i升高的抑制作用.提示谷氨酸诱导的Ca2+内流可能需要MAPK/ERKs信号通路的激活，而17β-E2也许是通过激活该通路促进谷氨酸诱导神经元Ca2+内流的.文献[27]认为，NMDA受体的激活部分受ERKs调控，NMDA受体亚基NR2B磷酸化的增加依赖于NR2B中酪氨酸的磷酸化作用，而这一作用(至少部分作用)经ERKs介导.NMDA受体的功能主要取决于NR2亚基的类型.文献[28]利用转基因技术研究发现，前脑过表达NR2B亚基的小鼠神经细胞NMDA受体通道开放时间延长、活性增加，并导致[Ca2+]i升高；同时，NR2B亚基过表达可增强LTP，学习和记忆能力也增强.本实验室前期的研究[29]发现，脑内注射17β-E2 1 h不影响海马脑区ERK1/2总蛋白的表达，但显著升高ERK1/2的磷酸化水平，表明17β-E2可以快速激活ERK通路；进一步用雌激素受体阻断剂ICI182780预处理后，发现17β-E2诱导的ERK1/2磷酸化水平增强效应被抑制，同时消除了17β-E2诱导的NMDA受体亚基NR2B磷酸化水平的增强效应.这些结果提示，雌激素可通过雌激素受体的非基因组机制激活MAPK/ERKs信号通路，快速诱导NMDA受体亚基NR2B磷酸化而激活 NMDA 受体.因此，笔者推测，谷氨酸可能通过促进MAPK/ERKs信号通路活动激活NMDA受体亚基NR2B磷酸化，从而使突触后膜离子通道打开，增加Ca2+内流；而17β-E2可能通过进一步激活该通路促进谷氨酸诱导神经元[Ca2+]i升高.由于胞内还有其他多条信号通路参与雌激素调节神经细胞活动，因此，雌激素对神经元[Ca2+]i的影响是否还有其他通路介导，还值得进一步研究.

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(责任编辑薛荣)

Rapid effects of 17β-estradiol on calcium level in hippocampal neurons of rats

SHEN Qiaoqiao,XU Xiaohong,DAI Yuhua,HU Yizhong

(InstituteofEcology,CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

It was investigated the effects of 17β-estradiol (17β-E2) on calcium level in hippocampal neurons of rats. After in vitro cultured for 8～10 days, the hippocampal neurons were marked by Fluo 4-AM, an intracellular Ca2+fluorescent probe. Laser confocal scanning microscopy was used to detect the dynamic change of glutamate-induced intrarcellular calcium concentration ([Ca2+]i). These results showed that treatment of 17β-E2 (10 nmol·L-1)for 30 min had no remarkable effect on [Ca2+]iof neurons in the normal condition, but rapidly enhanced the increase in the [Ca2+]iinduced by glutamate (P<0.001, compared with control). The pretreatment of estrogen receptor antagonist, ICI182780 (10 μmol·L-1) blocked this effect of 17β-E2. ERKs inhibitor, U0126 (10 μmol·L-1) significantly suppressed glutamate-induced increase of [Ca2+]i(P<0.001), suggesting ERKs signal participates in glutamate-induced calcium influx; however, this effect was reversed by pretreatment of 17β-E2. These results suggested that 17β-E2 could rapidly enhanced the increase in [Ca2+]iinduced by glutamate in hippocampal neurons in vitro. These effects might be mediated by ERKs signaling pathway via estrogen receptor.

17β-estradiol; calcium; hippocampal neuron; ERKs

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.03.016

收文日期：2015-09-10；2015-10-15

国家自然科学基金资助项目(81472935;81172627)

沈巧巧(1990-)，女，浙江嵊州人，硕士研究生.研究方向：神经毒理学.

胡一中.E-mail： huyizhong@zjnu.cn

Q955

A

1001-5051(2016)03-0325-06