葱兰叶挥发油成分分析及其对鲜牛奶的抑菌作用

卫　强 时雪风

(安徽新华学院药学院，安徽 合肥　230088)



葱兰叶挥发油成分分析及其对鲜牛奶的抑菌作用

卫强 时雪风

(安徽新华学院药学院，安徽 合肥230088)

采用水蒸气蒸馏(SDE)和超临界二氧化碳(SFE-CO2)提取叶中挥发油，以GC—MS检测分析，考察挥发油在4 ℃、10 d内对鲜牛奶致腐菌的抑菌效果。结果表明：两者不同成分有39种，其中SDE挥发油中主要有甲基环己烷、二十八烷、间二甲苯、邻苯二甲酸二丁酯；SFE-CO2挥发油主要有4-(4-乙基环己基)-1-戊基-环己烯、甲苯、邻苯二甲酸二异辛酯、1-乙氧基戊烷、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚。两者相同成分有16种，含量差异较大。SFE-CO2挥发油抑菌作用较强，MIC值范围为0.031～0.125 mg/mL。SFE-CO2挥发油成分为浓郁香气和更强的防腐效果提供了物质基础。关键词：葱兰叶；挥发油；鲜牛奶；抑菌活性；SDE；SFE-CO2

鲜奶含有丰富的脂肪、蛋白质、乳糖[1]，营养成分丰富。但极易发生变质、酸败，如乳酸菌可分解乳糖使牛奶发酵[2]；胨化菌使牛奶发生非酸性凝固，产生腐败气味[2]；荧光假单胞菌产生脂肪酶分解乳脂而生成具有臭味的低级酮类[3]；产气菌分解碳水化合物，产生二氧化碳、氢气、乳酸和有机酸，发生产气、酸性凝固现象[3]。目前，牛奶非法添加的化学防腐剂有不同程度的毒性或副作用，如苯甲酸可引起精子畸形[4]，对消化道内微生物以及消化道pH有一定影响[5]，尼泊金酯类对雌性激素有影响[6]，并有试验[3]表明其对男性睾丸存在危害。挥发油是多种小分子挥发性化合物的油状物质，其作为抑菌剂和防腐剂的作用已被证实，如肉桂精油可强烈抑制细菌、霉菌和酵母[7]，柑橘精油及其主要成分D-柠檬烯可抑制大肠杆菌、金葡菌、枯草芽孢杆菌、酵母、黑曲霉，应用于橙汁防腐[8]。

葱兰(Zephyranthescandida(Lindl.)Herb.)是石蒜科葱兰属植物，别名葱莲、玉帘、白花菖蒲莲、韭菜莲、肝风草，原产南美[9]。由于葱兰色泽艳丽、花期长，近年来被广泛用于城市园林绿化和观赏植物，世界各国均有引种栽培[10]，在中国栽培广泛。葱兰含有生物碱[11]、黄酮[12]、凝集素[13]、挥发油[14]等成分，药理试验[15]证明其生物碱成分对人上皮癌细胞、人表皮癌细胞、鼠淋巴肿瘤细胞P388-D1等有较强的抗肿瘤活性，挥发油成分具有清除DPPH和ABTS自由基作用[14]。传统的SDE提取具有高温，易引起挥发油成分氧化[16]。SFE-CO2萃取技术可实现常温提取和保持热敏性成分不被热分解[17]，可有效富集芳香活性物质，使挥发油更接近天然香韵[18]。葱兰叶中挥发油具有浓郁的香气，其化学成分研究国内外还未见报道。本研究拟运用SDE和SFE-CO2提取葱兰叶中挥发油，以气相色谱—质谱联用(GC—MS)研究其成分，进一步比较两种提取挥发油的成分和对鲜牛奶抑菌作用的差异，从该芳香植物中筛选天然活性成分，扩大在食品行业的应用。

1　材料与方法

1.1材料和仪器

葱兰叶：于2014年5月采自安徽合肥大蜀山地区，标本存于安徽新华学院药学院实验室；

鲜牛奶：批号20151002，光明乳业有限公司；

粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、腐败假单胞菌(Pseudomonadaceaeputrefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、产气荚膜杆菌(Clostridiumperfringens)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)：中国菌种保藏中心；

溶菌酶：酶活力> 2万U/mg，上海谷研实业有限公司；

所用试剂均为分析纯；

超临界萃取设备：HA221-50-01型，江苏南通华安超临界有限公司；

气相色谱仪：Agilent 6890-5973N型，安捷伦科技(中国)有限公司。

1.2试验方法

1.2.1挥发油的提取精密称取干燥粉碎后的葱兰叶200 g装入料筒，等份，一份以水蒸气蒸馏装置提取，收集油水混合物，以无水硫酸钠脱水，得挥发油，呈近无色，香味较淡；另一份放入超临界萃取装置萃取釜内，设置萃取压力45 MPa，萃取温度20 ℃，萃取流量20 L/h，萃取1.5 h后，打开分离釜排料阀，收集萃取物。萃取物经减压蒸馏后分别以环己烷、乙醚萃取，氮气吹去溶剂，得到挥发油，挥发油几近无色，香气浓郁。

1.2.2色谱条件HP-5 MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为高纯氦，不分流，进样量1 μL；程序升温，柱起始温度为40 ℃，保持1 min后以5 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至300 ℃，保持至完成分析。电子轰击能量60 eV，扫描范围m/z25～550，离子源温度220 ℃，接口温度280 ℃，全离子扫描。

1.2.3对牛奶的抑菌试验以溶菌酶为对照，制备溶菌酶、葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油肉膏平板培养基，浓度依次为2.000，1.000，0.500，0.250，0.125，0.062，0.031，0.016 mg/mL。在以上培养基上分别接种粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、腐败假单胞菌、枯草芽孢杆菌、产气荚膜杆菌、大肠杆菌、粪产碱杆菌、保加利亚乳杆菌，移入培养箱中37 ℃培养48 h，计算溶菌酶、葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，选择整体抑菌效果较好的挥发油组进行如下试验。

取800 mL的鲜牛奶均分为8份，鲜牛奶组设为空白对照组，加入质量浓度0.05%的溶菌酶鲜牛奶组设为阳性对照组，葱兰叶SDE和SFE-CO2挥发油均以10%吐温-80溶液稀释，分别按照质量浓度0.02%，0.04%，0.06%加入鲜牛奶设为样品组。采用平板菌落计数法(参照GB 4789.2—2010《食品微生物学检验菌落总数测定》)，分别按照一定的稀释梯度稀释，贮藏于冰箱4 ℃冷藏一定时间(0，2，4，6，8，10 d)，按式(1)计算菌落总数：

(1)

式中：

N——样品中菌落数，CFU；

∑C——平板菌落数之和，个；

n1——低稀释倍数平板个数，个。

n2——高稀释倍数平板个数，个。

d——稀释因子。

1.2.4数据处理通过面积归一化法测定鉴定的化合物的相对含量，检索为NIST2011数据库。

2　结果与讨论

2.1葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油化学成分

葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油化学成分测定结果见图1和表1～3。

由表1可知，从葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油中共鉴定出55种化学成分，主要有烃类、酯类、苯类、醇类、醛类、酮类、酸类、醚类、杂环类等。其中从葱兰叶SDE 和SFE-CO2挥发油中共鉴定出37，34种挥发性成分，分别占总挥发性成分的74.16%，92.40%。由表2可知，SFE-CO2挥发油中醇类、烃类、苯类、醛类、酮类、酯类含量均高于SDE挥发油，且不含酸类、醚类、杂环化合物，说明两者挥发油含量和种类差别较大。由表3可知，两者挥发油的特征成分具有显著差异，SDE和SFE-CO2挥发油中最高含量的化学成分分别是甲基环己烷(15.96%)、4-(4-乙基环己基)-1-戊基-环己烯(8.73%)。与文献[14]葱兰花SDE挥发油成分相似。但花

图1　葱兰叶中挥发油总离子流

Figure 1Total ion chromatogram of SDE and SFE-CO2volatile oil of leaf fromZephyranthescandida(Lindl.)herb.

表1葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油中化学成分

Table 1SDE and SFE-CO2volatile oils' chemical constituents of leaf fromZephyranthescandida(Lindl.)Herb.

种类保留时间/min化合物名称相对含量/%SDESFE-CO2烷烃类 4.8341-乙氧基戊烷-6.365.077甲基环己烷15.96-17.153十二烷-0.4218.8852,6,10-三甲基十四烷0.300.3619.957十三烷-1.2921.9542,6,10-三甲基十二烷-0.7822.614十四烷-2.5225.467十五烷-2.8827.848十六烷0.152.9428.725氯代十八烷0.51-29.5752,6,10,15-四甲基十七烷1.172.9429.586十七烷1.14-30.5714-(4-乙基环己基)-1-戊基-环己烯-8.7332.406二十七烷1.322.5835.0313-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷0.781.7136.281二十一烷3.45-40.974反式角鲨烯0.90-42.116二十八烷5.34-酯类5.364乙酸(6-庚烯-1-基)酯1.02-6.311醋酸正丁酯1.681.9831.843丁基邻苯二甲酸十四酯2.04-32.601十六酸甲酯0.96-32.963邻苯二甲酸二丁酯5.103.2132.979邻苯二甲酸-丁基-8-甲基壬酯-4.8938.198邻苯二甲酸二异辛酯4.747.17苯类5.045甲苯-8.257.443乙苯2.644.657.654间二甲苯5.25-8.255对二甲苯1.652.5810.1221-乙基-3-甲基苯0.30-10.2251-乙基-2-甲基苯0.18-11.0201,2,3-三甲苯0.150.2412.276邻甲基苯乙烯-0.1220.3084-乙烯基-2-甲氧基苯酚3.665.9724.8982,4,6-三甲氧基甲苯0.81-25.6782,4-二叔丁基苯酚1.835.58醇类7.0203-己烯-1-醇-3.6313.851α-(1-庚烯基)-α-甲基苯甲醇-0.1225.8623,7,11-三甲基十二醇0.21-31.523叶绿醇2.401.7431.3182-十八烷氧基乙醇0.18-35.491(Z)-2-(9-十八碳烯基氧基)乙醇0.42-40.9742,2,4-三甲-3-(3,8,12,16-四甲基-十八烷基-3,7,11,15-四烯基)-环己醇0.90-

续表1

种类保留时间/min化合物名称相对含量/%SDESFE-CO2醛类5.673辛醛-0.606.409糠醛-0.9612.590苯乙醛-0.2414.371壬醛-0.1522.880十二醛-0.9623.6814,6-二羟基-2,3-二甲基苯甲醛3.482.73酮类8.1142-甲基环戊酮-1.5029.1422-羟基-4,6-二甲氧基苯乙酮1.441.6230.4193,5,6,7,8,8α-六氢-4,8α-二甲基-6-(1-羟甲基乙烯基)-(1H)-萘-2-酮0.87-杂环27.0584α-乙酰氧基-5,5,8α-三甲基-八氢苯并[b]吡喃0.36-酸类32.7096-(1,1-二甲基乙基)-2,3-二氢-1,1-二甲基-1H-茚-4-乙酸0.51-醚类27.0364-羟基-3-叔丁基-苯甲醚0.36-

表2　SFE-CO2和SDE挥发油中不同成分的数目和含量对比

表3　两类挥发油主要成分比较

以脂肪酸(22.05%)、萜类及其含氧衍生物(13.53%)、烷烃(13.19%)和醛(6.93%)为主，主要成分有棕榈酸(12.12%)、亚油酸(9.67%)、二十三烷(7.57%)、庚醛( 5.90%)、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚(5.36%)、2，6-二叔丁基对甲酚(5.33%)等。花、叶挥发油共有成分有十五烷、十六烷、十七烷、二十一烷、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、糠醛、苯乙醛。

葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油中共同成分有16种，分别为：2,6,10-三甲基十四烷、十六烷、2,6,10,15-四甲基十七烷、二十七烷、3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷、醋酸正丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异辛酯、乙苯、对二甲苯、1,2,3-三甲苯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、叶绿醇、4,6-二羟基-2,3-二甲基苯甲醛、2-羟基-4,6-二甲氧基苯乙酮。相同成分中绝大多数成分以SFE-CO2挥发油中含量较高，葱兰叶SDE仅有邻苯二甲酸二丁酯(5.10%)、叶绿醇(2.40%)、4,6-二羟基-2,3-二甲基苯甲醛(3.48%)含量偏高。

2.2对牛奶的抑菌作用

由表4可知，葱兰叶SFE-CO2挥发油对粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、腐败假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、产气荚膜杆菌、粪产碱杆菌、保加利亚乳杆菌有较强抑制力，其MIC值范围为0.031～0.062 mg/mL，而葱兰叶SDE挥发油相对抑制力较弱，其MIC值范围为0.062～2.000 mg/mL。由表5可知，与空白组对照，在4 ℃冰箱中放置0～10 d，随着葱兰叶SDE和SFE-CO2挥发油添加浓度的提高，对鲜牛奶有明显抑菌作用，而SFE-CO2挥发油组抑菌作用强于SDE挥发油组。溶菌酶对G+菌抑制作用较强，但对G-菌，包括一些主要的食源性病原体无效，在食品应用上受到一定限制[19]。

表4葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油抗菌试验的MIC值

Table 4　Antimicrobial MIC of SDE and SFE-CO2 essential oils from Zephyranthes candida(Lindl.)Herb. (n=3) mg/mL

表5葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油处理前后对鲜牛奶中微生物中菌落数的影响†

Table 5　Affect on the total count of microorganisms before and after milk processing with SDE and SFE-CO2 essential oils from Zephyranthes candida (Lindl.)Herb. CFU/mL

†放置4 ℃冰箱中。

3　结论

从葱兰叶SDE、SFE-CO2挥发油中共鉴定出55种化学成分，其中不同成分39种，分别占41.67%，44.40%；相同成分16种，分别占32.49%，48.00%。其不同成分类别差异明显，其中SFE-CO2挥发油不含醚类、酸类和杂环成分；相同成分含量差异较大，多数以SFE-CO2挥发油含量较高。说明成分差异决定挥发油品质，对其香型也产生决定性影响， SFE-CO2挥发油香气浓郁的结果与其成分组成密切相关。另外，葱兰叶挥发油成分对鲜牛奶的抑菌作用结果显示，SFE-CO2挥发油对引发牛奶变质的粘质沙雷氏菌等有较强抑制力，其MIC值范围为0.031～0.125 mg/mL。研究[20-21]表明，多种酚类成分是抗菌的有效成分。酚羟基是起抗菌作用的主要官能团，邻位甲氧基能提高抗菌活性，抗菌活性可能还与电性、疏水性和空间结构有关。SFE-CO2挥发油显示较强的抗菌活性，可能与其含有较高的苯类成分有关(27.39%)。本试验从挥发油成分与香气和对鲜牛奶的抑菌作用的关系两个方面说明SFE-CO2萃取具有更好的技术优势。

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The analyses on chemical components in the leaf volatile oils of Zephyranthes candida(Lindl.)Herb. and their antimicrobial activities in the fresh milk

WEI QiangSHIXue-feng

(PharmacySchool,AnhuiXinhuaUniversity,Hefei,Anhui230088,China)

Two kinds of volatile oil were extracted by steam distillation extraction (SDE) and supercritical fluid extraction of CO2(SFE-CO2), and then they were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC—MS). The antimicroble effects of the extract on different rot funguses in fresh milk was evaluated in 4 ℃ within 10 days. There were 39 different components in the two kinds of volatile oil, including methyl cyclohexane, octacosane, 1,3-dimethyl-benzene, and dibutyl phthalate mainly found in the SDE volatile oil, and 4-(4-ethylcyclohexyl)-1-pentyl-cyclohexene, toluene, 1,2-benzenedicar-boxylic acid, diisooctyl ester, 1-ethoxy-pentane, 2-methoxy-4-vinylphenol, and 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol mostly presented in the SFE-CO2volatile oil. The differences among the contents of 20 common components in two oils was great. The SFE-CO2volatile oil showed more effective antimicrobial activity with the MIC range of 0.031～0.125 mg/mL. Moreover, those from SFE-CO2volatile oil coulld also provide better exotic perfume and stronger antiseptic functions.

leaf fromZephyranthescandida(Lindl.)Herb.; volatile oil; fresh milk; antimicrobial activities; SDE; SFE-CO2

安徽省质量工程项目(编号：2014zy078)

卫强(1977-)，男，安徽新华学院副教授，硕士。

E-mail: weiqiang509@sina.com

2015—12—21

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.006