复方五倍子洗液对白色念珠菌体外抑制实验的探讨*

王亚萍　陈　锴　李宝莉　郭姝彤　刘永仙

延安大学医学院(延安716000)



复方五倍子洗液对白色念珠菌体外抑制实验的探讨*

王亚萍陈锴△李宝莉郭姝彤刘永仙▲

延安大学医学院(延安716000)

目的:探讨复方五倍子洗液对白色念珠菌的体外抑制实验的最佳剂量组合。方法:运用正交t检验探讨复方五倍子洗液最佳剂量组合。结果:五倍子、白芷、石斛、当归4味药起主要作用,川穹起辅助作用,丁香、珍珠、红参起拮抗作用。结论:复方五倍子洗液的处方最佳剂量组合为A1B2C1D1E1F2G1H2。

主题词白色念珠菌@复方五倍子洗液

白色念珠菌是真菌属中较为常见的条件致病菌。近几年来,由于抗生素、免疫抑制剂药物的大量的使用及其抗肿瘤药物的应用致使机体正常菌群发生失调，导致白色念珠菌的感染率及其发病率逐渐上升[1]。由白色念珠菌引起的阴道炎，发病率呈逐年增多，这可能与患者自身的免疫力下降及干扰患者生活质量紧密相关[2-4]。在临床上，较常见的妇女阴道主要以白色念珠性致病性为主，被称作做真菌性或者念珠菌性阴道炎(Vulvovaginal Candidiasis，简称VCC)，主要是指由白色念珠菌感染而引起阴道炎症，是女性妇科生殖道常见致病菌之一。白色念珠菌感染后的临床症状主要以白带量增多、黏稠、外阴瘙痒及红肿、热痛等为主，而如何抵制致病菌、达到消炎的目的是阴道炎治疗的关键问题。当前，临床主要以应用广谱抗生素类药物及抗真菌类药来达到治疗的目的，但是长期应用后，耐药性问题尤显突出，给以后的诊断、治疗造成极严重的困难，显著威胁着患者的心身健康，是造成威胁患者死亡的重要原因之一。当前，临床上经常使用抗念珠菌类的药物如酮康唑、咪康唑及氟康唑等，尽管有一定的临床效果，但其复发率较高[5]，而且有部分患者已经产生了耐药性，致使感染了白色念珠菌的治疗将要遇到新的挑战[6]。所以, 研制出一类抗念珠菌的新型药物，使其不容易形成耐药性且毒副低，是当前研究的热点之一。本文经多方研究探讨制备复方五倍子洗液作用妇女念珠菌阴道炎，复方五倍子洗液是由八味中草药组成，其成分是:五倍子、丁香、石斛、当归、珍珠粉、白芷、红参、川芎等组成，其中五倍子味酸、寒，能收涩止带；白芷性温味辛，能除湿止痛；二药共为主药。当归味甘、辛，能补血和血；石斛味甘，具有滋阴生津的功效；人参味甘、性微温，有大补元气，强精通脉，延缓衰老，珍珠味甘，性寒。丁香味辛、性温，补肾助阳。五药共为臣药，川芎性辛、温，具有活血行气之功效。珍珠则解毒生肌，辅助君药，增强君药之职。为了得到八味中草药的最佳剂量组合，运用正交t检验实验方法，探讨其最佳药物剂量配伍组合。

1仪器与试药1.1实验中草药五倍子(Rhus chinensis Mill.)、白芷 (Angelica dahurica)、石斛(Dendrobium nobileLindl)、丁香(Syringa Linn)、川芎(Ligusticum chuanxiong hort)、当归(Angelica sinensis)、珍珠(Marfarita)、红参(radix ginseng rubra)等八种均购自延安大学附属医院中药房。

1.2受试菌种标准菌白色念珠菌(canidia Albicans) KWIK-STIKTM购自美国菌种保藏中心(ATCC10231)。

1.3培养基 沙保氏琼脂培养基(蛋白胨10g, 牛肉膏3g ,氯化钠5g, 琼脂20g，葡萄糖40g, 氯霉素0.05g，蒸馏水1000ml,调PH值4-6)；肉汤培养基(牛肉膏3g, 氯化钠5g, 蛋白胨10g,蒸馏水1000ml,调pH7.8高压灭菌15min)；分别经高压灭菌15min，分装，冷却，4℃冰箱保存备用。

1.4实验仪器手提式高压锅、培养箱、冰箱、无菌工作台、电暖套、电子天平、无菌平皿、无菌试管、烧杯、酒精灯、移液器、接种环、游标卡尺、无菌棉签等。

2方法2.1菌液的准备按照说明书Kwik-Stik 操作流程，在无菌环境下，采用划线接种法，接种于沙保平板培养基， 24h可见菌落形成，提取菌落做革兰氏染色，镜下确定是白色念珠菌。用接种环挑取单菌落，接种于5 ml普通肉汤培养基中，37 ℃培养24 h后，取0.5 ml于沙保氏琼脂培养基培养 24 h，将菌落用灭菌生理盐水洗后稀释，用平皿倾注法测试活菌数后将其稀释至1.0×109cfu/ ml，即制成试验菌液。

2.2中草药醇提液的制备各称取一定量的中药药材,破碎后除去虫垢及其杂质,并冲洗干净,后干燥、粉碎，经40目过筛,复方五倍子制剂分别为：五倍子30g,丁香、白芷、川芎、石斛、当归各10g，珍珠40g，红参50g。按实验需求组合分组后加80%乙醇，水浴3h，过滤，抽离,萃取，计算萃取率为17.27%，经旋转蒸发器蒸发酒精，烘干，刮取干粉，蒸馏水配液，得出原液浓度为4.21g/l，用无菌过流器过滤药，分装于无菌管中，4℃冰箱保存备用。

2.3因素水平的确定试验选用 L12(211)正交t值表[7]进行安排，处方中8味中药构成8个因素。以各药高剂量为水平1,低剂量为水平2。因素水平(见表1)。

表1　因素及水平

2.4分组按照正交设计的实验，共安排12组实验。试验采用打孔法[8]，吸取0.1 ml试验菌悬液,涂满于沙保氏琼脂平板表面,用直径6 mm打孔器在平板上打孔，均匀打6空, 除去孔内琼脂并用少量营养琼脂封闭孔底，在孔内滴加0.1 ml各组中草药提液,置37℃培养24h后测定抑菌圈的直径。计算各组抑菌圈直径。试验重复5次。

3结果从表中可以看出，因素A,C,E,对细菌的抑制作用有显著的差异，因素G对细菌的抑制差异性不显著，而因素B,F,H数值较小，可能误差所致，单独应用对炎症影响不大，这符合当初实验设计的要求。从实验分析得知八种中草药抗菌药效较显著着依然是五倍子，白芷，石斛(为主药)，当归和川穹作用不显著(可能为辅药)，丁香、珍珠、红参为作用不明显，但可提高机体免疫功能。故优化组合是A1B2C1D1E1F2G1H2，既五倍子、白芷、川穹、石斛、当归五味药物组合可取得抗白色念珠菌最高药效,见表2。

表2　实验安排表

4讨论目前，较常见的妇女阴道感染主要以白色念珠性致病性为主，被称作做真菌性或者念珠菌性阴道炎(Vulvovaginal Candidiasis，简称VCC)，主要是指由白色念珠菌感染而引起阴道炎症，是女性妇科生殖道常见致病菌之一[9-10]。中草药作为纯天然的药物,日益受到国内外学者的重视，其具有价格廉、无药物残留等优点,越来越受到研究者们的欢迎。因此，如何开发具有抗真菌性感染，且具有毒副作用小，又适合免疫力低下人群，是目前研究的热点。

本文探讨复方五倍子等8味中草药，应用80%乙醇提取，制成复方洗剂，对标准菌白色念珠菌进行体外实验，观察其对白色念珠菌的抑菌效果。为临床妇科阴道炎的治疗研发新型有效的抗真菌药物做基础研究，为更好的探讨本组方组成剂量的合理性、有效性、对真菌药物的最佳抗菌性，对该组方用正交t检验法的进行实验研究。正交t检验源于正交设计, 是中药方剂的研究，适合4～11味药物的，特点是不含剂量间的交互作用的都不列在表内,所以用组数少的来分析组数多的因素。而中药组方方剂的分析常用两个水平,即用药或者不用药, 小剂量或者大剂量,且两水平f值恒为t值的平方因此可简化计算。用正交t值较处方优选,对主药的分析，辅药交互的分析以及剂量的分析[11]。本实验通过正交t检验测得最佳剂量比为A1B2C1D1E1F2G1H2，测得了最佳的抑菌效果，希望能更好的发挥临床疗效，增强其对白色念珠菌性阴道炎最佳抑菌效果。

复方五倍子洗剂中五倍子味酸、寒，能收涩止带；白芷性温味辛，能除湿止痛；二药共为主药。当归味甘、辛，能补血和血；石斛味甘，具有滋阴生津的功效；人参味甘、性微温，有大补元气，强精通脉，延缓衰老，珍珠味甘，性寒。丁香味辛、性温，补肾助阳。五药共为臣药，川芎性辛、温，具有活血行气之功效。珍珠则解毒生肌，辅助君药，增强君药之职。本次实验结果只针对五倍子等 8种中草药对白色念珠菌体外的抑菌作用做了初步的研究，而中草药组方作用于人体疾病的药理过程相对复杂等特点，若将其应用对抗白色念珠菌性阴道炎的效果还有待下一步动物实验模型观察和对临床妇科念珠菌阴道炎体外实验研究进行确定。

[1]Kim H,Jung KW,Meng S,et al.Network-assisted genetic dissection of pathogenicity and drug resistance in the opportunistic human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans[J].Scientific reports,2015,3(5):8767-8777.

[2]Peters BM,PalmerGE,Nash AK,et al.Fungal morphogenetic pathways are required for the hallmark inflammatory response during Candida albicans vaginitis[J].Infection and immunity,2014,82(2):532-543.

[3]Mohamadi J,Havasian MR,Panahi J,et al.Antifungal drug resistance pattern of Candida. spp isolated from vaginitis in Ilam-Iran during 2013-2014[J]. Bioinformation,2015,11 (4): 203-206.

[4]De Bernardis F ,Arancia S ,Sandini S,et al.Studies of Immune Responses in Candida vaginitis[J]. Pathogens 2015,4 (4): 697-707.

[5]Nasrollahi Z , Yadegari MH , Roudbar Mohammadi S,et al. Fluconazole Resistance Candida albicans in Females With Recurrent Vaginitis and Pir1 Overexpression[J].Jundishapur J Microbiol ,2015,8 (9): 21468-21476.

[6]Den A,Durukan H, Güzel AB,et al.Genotyping of Vaginal Candida glabrata Isolates Using Microsatellite Marker Analysis and DNA Sequencing to Identify Mutations Associated with Antifungal Resistance[J]. Mikrobiyol Bul,2013,47 (1): 109-121.

[7]Zhou C,Hu J,Ma H.Antioxidant peptides from corn gluten meal: Orthogonal design evaluation[J].Food chemistry,2015,14(1):1771-1781.

[8]Yang JF,Yang CH,Chang HW,et al.Chemical composition and antibacterial activities of Illicium verum against antibiotic-resistant pathogens[J].J Med Food,2010,13(5):1254-1262.

[9]Kovachev S.Vaginal ecosystem[J].Akusherstvo i ginekologii,2011 ,50 (3): 41-49.

[10]石晓,王素燕.我国阴道炎患者阴道分泌物病原体分布情况[J].中国实验诊断学,2012,16(1):138-140.

[11]盛亮亮,贾冬,孙科峰,等.正交t值法筛选“养血止痒方”最佳配伍实验研究[J].辽宁中医药大学学报,2010,12(11):235-236.

(收稿2016-02-23；修回2016-04-26)

*陕西省延安市科学技术研究发展计划项目(2013-KW30)

△延安大学附属医院(延安 716000)

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10.3969/j.issn.1000-7369.2016.09.064