RDG修饰共载多烯紫杉醇和苏拉明脂质体乳腺癌靶向治疗研究

郭发爽

(解放军159中心医院 乳腺外科　河南 驻马店　463000)



RDG修饰共载多烯紫杉醇和苏拉明脂质体乳腺癌靶向治疗研究

郭发爽

(解放军159中心医院 乳腺外科河南 驻马店463000)

目的探讨RDG修饰共载多烯紫杉醇(DOC)和苏拉明(Su)脂质体(RDGLP-DOC/Su)对乳腺癌的靶向治疗价值。方法采用薄膜分散法制备RDGLP-DOC/Su，并同时制备RGD修饰苏拉明脂质体(RGDLP-Su)、RGD修饰多烯紫杉醇脂质体(RGDLP-DOC)，采用MMT法检测HUVEC细胞和MCF-7细胞在不同脂质体中的增殖，采用流式细胞术检测不同脂质体中细胞的摄取量。结果RGDLP中肿瘤细胞摄取量明显高于普通脂质体(P<0.05)；RGDLP-DOC/Su对于乳腺癌细胞MCF-7、HUVEC的增殖抑制具有交互作用，明显高于RGDLP-Su、RGDLP-DOC(P<0.05)。结论RGDLP-DOC/Su可有效抑制乳腺肿瘤生长和细胞增殖，具有较强的靶向治疗效果，可作为今后肿瘤靶向治疗的研究方向。

乳腺肿瘤；脂质体；多烯紫杉醇；苏拉明

靶向血管抗肿瘤是近年来新兴的一种肿瘤治疗方法，通过阻断瘤体血管进而造成肿瘤细胞氧气和营养供应不足，使其缺血坏死[1]。苏拉明(Su)和多烯紫杉醇(DOC)均是常用的抗肿瘤药物，但单独应用对于肿瘤的杀伤效果较为有限。临床研究指出，肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞均存在整合素受体的高度表达[2]。本研究通过制备RGDLP-DOC/Su脂质体并进行相关分析，旨在为乳腺癌靶向治疗提供可靠的参考依据。

1　材料与方法

1.1动物模型及细胞本研究中HUVEC血管内皮细胞由上海细胞研究所提供，MCF-7乳腺癌细胞由ATCC提供。由本地实验动物公司提供雌性裸鼠模型58只，周龄为4～6周，体质量为21～26 g，动物合格证号为2013001619132。

1.2主要试剂DMEM培养基和胎牛血清由赛默飞世尔生物化学制品有限公司提供，DOC(99.7%，产品批号为S05055)由江苏恒瑞医药股份有限公司提供，Su(98.0%，产品批号为A0272256)由Sigma公司提供，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)由上海吉尔生化公司提供。

1.3脂质体制备参照Guo J等提出的方法进行RGD-PEG2000-DSPE合成，取Su 0.30 mg，DOC 0.33 mg，RGD-PEG2000-DSPE 1.10 mg，胆固醇0.96 mg，大豆磷脂12.05 mg，在氯仿中溶解，并于茄型瓶中进行减压蒸馏，制备成膜，将有机溶剂去除，在充分干燥后同PBS 1 ml混合后水化，以(80 W，10 s，5次)超声制成RGDLP-DOC/Su，使用相同方法制备RGDLP-DOC和RGDLP-Su脂质体。

1.4细胞摄取测试按照5×105/孔密度进行对数生长期细胞接种，培养后取适量普通脂质体和RGDLP加入孔中，维持孔中脂质体浓度在0.2 mg/ml。孵育后将脂质体培养基去除，使用冷PBS进行清洗，并以0.25%胰酶进行消化，离心后使用流式细胞仪进行细胞荧光值测定。将细胞与脂质体共同孵育4 h，观察脂质体的细胞摄取情况，使用PBS对细胞进行漂洗，同DAPI 2 μg/ml混合，在室温下孵育20 min，使用冰PBS漂洗3次，取4%多聚甲醛固定15 min，弃去多聚甲醛，使用冰PBS保存。在激光共聚焦荧光倒置显微镜中观察细胞摄取情况。

1.5细胞抑制检测使用胰酶对MCF-7细胞进行消化，高速离心后置于DMEM培养液中，调节浓度至5×107/ml。取制备好的MCF-7细胞悬浊液进行裸鼠背部接种，接种成功后，将裸鼠随机分为PBS组、RGDLP-DOC组、RGDLP-Su组、RGDLP-DOC/S组，于肿瘤生长21 d后，取下肿瘤并称取体质量，计算生长抑制率。

2　结果

2.1生长抑制RGDLP-DOC、RGDLP-Su对于乳腺癌细胞MCF-7、HUVEC的生长抑制率差异无统计学意义(P>0.05)，但RGDLP-DOC/Su对于乳腺癌细胞MCF-7、HUVEC的增殖抑制具有交互作用，明显高于RGDLP-Su、RGDLP-DOC，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　不同脂质体对乳腺肿瘤细胞的生长抑制情况(%)

2.2 细胞摄取细胞摄取定量检测显示，RGDLP中MCF-7细胞摄取量为(68.2±2.6)，HUVEC细胞摄取量为(15 041±5.8)；普通脂质体中MCF-7细胞摄取量为(28.3±1.7)，HUVEC细胞摄取量为(50.1±3.7)，RGDLP中肿瘤细胞摄取量明显高于普通脂质体，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3　讨论

脂质体是一种双层膜球形结构，其成分以磷脂为主。临床研究指出，肿瘤内皮血管表面和肿瘤细胞均存在大量整合素受体的表达，RGD作为一种环状三钛，可同整合素受体特异性结合[3]。本次研究中，将RGD同Su、DOC脂质体表面相结合，对乳腺肿瘤新生血管和癌细胞进行靶向抑制。王晓珊等[4]研究指出，在RGD修饰脂质体上进行DOC和Su联合包载可有效提高肿瘤血管细胞和肿瘤细胞对脂质体的摄取。RGD修饰脂质体中肿瘤细胞摄取率明显高于普通脂质体，同相关报道中的结论基本一致[5]，提示采用RGD修饰脂质体对Su和DOC进行包载后，可促进抗肿瘤药物介导性的显著提高。对于解决肿瘤内部血管少且压力高，给药系统无法深入问题具有十分积极的作用。

为进一步证实RGDLP-DOC/Su对于乳腺癌的靶向治疗作用，本研究结果显示， RGDLP-Su、RGDLP-DOC脂质体对于乳腺癌细胞增殖的抑制效果较为有限。在RGDLP-DOC/Su脂质体中，乳腺癌细胞生长抑制率高达80%以上。一方面证实RGD修饰脂质体可有效增强抗肿瘤药物的靶向治疗效果，另一方面提示抗血管药物Su和细胞毒性药物DOC连用可有效增强肿瘤治疗效果。

综上所述，RGDLP-DOC/Su可有效抑制乳腺肿瘤生长和细胞增殖，具有较强的靶向治疗效果，可作为今后肿瘤靶向治疗的研究方向。

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10.3969/j.issn.1004-437X.2016.08.045

2016-03-10)