固相萃取结合气相色谱-火焰离子化检测器分析面包中饱和烃类矿物油

安红梅，柯润辉*，刘秀，田菲菲，王丽娟，黄新望，尹建军

1(中国食品发酵工业研究院，北京，100015) 2(岛津(中国)有限公司，北京，100020)



固相萃取结合气相色谱-火焰离子化检测器分析面包中饱和烃类矿物油

安红梅1，柯润辉1*，刘秀1，田菲菲2，王丽娟1，黄新望1，尹建军1

1(中国食品发酵工业研究院，北京，100015) 2(岛津(中国)有限公司，北京，100020)

为分析面包中饱和烃类矿物油(mineral oil saturated hydrocarbons,MOSH)，建立了一种硝酸银硅胶固相萃取GC-FID方法。在优化的前处理及色谱条件下，面包中的MOSH最低检出限为1.0 mg/kg，定量限为3.0 mg/kg，一定范围内线性良好(R2=0.999 1)，回收率(90.4%～105.1%)和相对标准偏差(3.29%～5.77%)(n=6)均满足方法性能要求。实际样品的分析表明,面包中的MOSH的含量较高，其中MOSH(n-C16-C24)最高为101.4mg/kg，MOSH(n-C24-C35)最高为71.3mg/kg。

饱和烃类矿物油(MOSH)；面包；气相色谱-火焰离子化检测器(GC-FID)；硝酸银硅胶固相萃取

食品中烃类矿物油污染由来已久[1]，自2008年乌克兰葵花籽油受矿物油污染事件以来备受关注[2]。烃类矿物油(mineral oil hydrocarbons，简称MOH)指石油原油经精馏纯化等步骤形成的石油产品或从有机废物中合成的复杂烃类混合物，包括由直链、支链烷烃(此二者统称为石蜡)以及环烷烃组成的饱和烃类矿物油(mineral oil saturated hydrocarbons，简称MOSH)和芳香烃类矿物油(mineral oil aromatic hydrocarbons，简称MOAH)[3]。不同于传统认识上的食品污染物，MOH组分的复杂性使其在GC-FID上以驼峰(复杂性不溶物峰)的形式存在[4]。欧洲食品安全局(EFSA)的研究显示：经食物摄入的n-C16-C35之间的MOSH可能会在体内累积，从而导致淋巴结、脾脏和肝脏的微肉芽肿；而MOAH具有极大的潜在致癌性[3]。食品中MOSH的污染占MOH污染量的大部分，是食品受MOH污染的标志[5]，故MOSH的污染研究一直是该领域的研究热点[6-7]。研究表明，MOSH是累积在人体内量最大的污染物[8]。自20世纪90年代起不同食品中MOSH污染的研究相继报道出来[9-10]，其中谷物制品、大米及植物油等食品中MOSH含量相对较高。

面包作为西方人的主食，在其日常膳食中占有重要地位[11]。近年来，我国面包人均年消费量也逐年递增，面包年产量已超160万t[12]。2012年，EFSA在欧洲国家征集面包、大米等食品中MOSH污染数据以便进行进一步的风险评估。瑞士苏黎世州食品监管局(KLZH)所检测的101个面包样品中，MOSH的平均含量为261 mg/kg，最高达2 800 mg/kg，碳链数在n-C17-C30之间[3]。目前各国尚未制定食品中MOSH的限量，其障碍之一是缺少有效的标准检测方法。当前，MOSH检测中使用较多的方法是GROB等人建立的在线高效液相色谱-气相色谱-火焰离子化检测器方法(on line-HPLC-GC-FID)[13]。该方法灵敏度和自动化程度均较高，但价格昂贵、对人员要求高、方法普及难度大。与自动在线技术相比，离线固相萃取-气相色谱火焰离子化检测器方法(SPE-GC-FID)具有节省溶剂、简单易操作及可批量处理等优点，经过浓缩步骤后灵敏度也能满足检测需求[9]。目前，国内仅有少量文献报道食品中石蜡的定性检测方法[14-15]，尚未见MOSH定量检测方法的报道。本文以面包为研究对象，通过对样品前处理方法和色谱分离条件进行系统优化，建立了一种简便、准确测定面包中MOSH含量的SPE-GC-FID的方法，能有效去除样品基质中的干扰组分，方法学指标均满足实际检测要求。本方法已应用于市售面包中MOSH的定量检测。

1　材料与方法

1.1样品

面包样品10个，购自当地超市。

1.2试剂与仪器

二氯甲烷、甲醇、正己烷和丙酮均为色谱纯(美国Dikma公司)；硅胶(Lichrospher Si 60，粒径0.063～0.200 mm，德国Merck公司)，使用前于600℃烘烤4 h；硝酸银为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

食品级白矿物油标准品(由支链烷烃和环烷烃组成)，纯度99.9%(VG15润滑油公司)；n-C8-C40正构烷烃混和标样(100 mg/kg)(上海安谱公司)。

气相色谱仪(GC-2010，配有FID检测器，日本岛津公司)；氮气吹干仪(DC-12，上海安谱公司)； Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；数控超声波清洗器(KQ5200DB，昆山市超声仪器有限公司)。

医用玻璃注射器(5 mL，金坛市第二注射器厂)；固相萃取小柱筛板(天津博纳艾杰尔公司)。(注：关键玻璃器皿需依次用超纯水、甲醇、丙酮和正己烷冲洗，以防止背景污染。)

1.3标准溶液的配制

称取0.100 g食品级白矿物油，用正己烷溶解并定容至100 mL，配制成1 g/L的单一标准储备液，于4℃冰箱保存。使用前根据需要将食品级白矿物油和n-C8-C40正构烷烃混和标样的标准储备液用正己烷配制成适当浓度的混合标准工作液(即MOSH工作液)。

1.4样品制备

1.4.1提取

称取研磨均匀的面包试样5.0g(标示脂肪含量一般为10%～35%)于25 mL具塞比色管中，加入20 mL正己烷，涡旋 10 min，超声1 h。取1 mL正己烷相于5 mL玻璃比色管中，待净化。(注：实验人员操作过程中应避免戴乳胶手套和擦拭护手霜，以免干扰实验结果。)

1.4.2净化

1.4.2.1固相萃取小柱的制备

质量分数为1%的硝酸银硅胶的制备：将0.5 g硝酸银溶解到盛有50 mL超纯水的圆底烧瓶(事先用铝箔纸包裹以防止硝酸银硅胶见光失效)中，再加入49.5g硅胶，于70℃水浴、12 kPa真空度下减压干燥混匀3 h，然后放入气相色谱仪柱温箱中125℃保持15 h，置于干燥器皿内，备用。质量分数为10%和0.3%的硝酸银硅胶制备过程类似。

准确称取1.0 g 质量分数为1%的硝酸银硅胶填料于装有筛板的5 mL玻璃固相萃取柱体中(事先用铝箔纸包裹)，轻轻敲实，用6 mL正己烷预淋洗SPE柱。

1.4.2.2固相萃取柱净化

取1 mL样品提取液上样后，用1 mL正己烷洗脱死体积，弃去。再用2.0 mL正己烷洗脱于KD浓缩管中，控制流速1 mL/min。为了达到一定的灵敏度，柔和氮气吹至0.1 mL，上GC-FID检测。

1.5气相色谱条件

色谱柱：DB-1石英毛细管柱(15 m×0.25 mm×0.1 μm)；柱温为50℃保持4 min，以40℃/min的速率升至330℃，保持10 min；载气为高纯度氮，柱流速为2.00 mL/min；氢气流量为30 mL/min；空气流量为400 mL/min；采用无分流进样，进样量1 μL；进样口温度300℃；FID检测器温度345℃。

2　结果与讨论

2.1提取体积的优化

实验过程中通过向空白面包中添加一定量的MOSH标准工作液，考察提取剂体积对回收率的影响。由图1可以看出，一定范围内MOSH的回收率随着提取剂体积的增大而增大，当提取剂用量增至10 mL以上其回收率没有显著增加(如图1所示)。故最终确定提取体积为10 mL。

图1　提取剂体积对提取效果的影响Fig.1　Effect of solvent volume on extraction efficiency

2.2固相萃取条件的选择

由于食品基质中含有大量的脂肪、色素以及萜烯类等物质，会严重干扰MOSH组分的定性和定量，因此溶剂提取之后的净化步骤必不可少。

2.2.1固相萃取填料的选择

虽然硅胶填料能保留脂肪等干扰物，从而在一定程度上将MOSH与杂质分离开来，但其分离效率不够理想[4]。硝酸银硅胶是在硅胶的基础上络合AgNO3所形成，它基于AgNO3与含有双键(或不饱和键)的物质结合形成配合物，且不同物质形成的配合物的稳定系数不同，通过不同极性的洗脱溶剂洗脱从而达到分离的目的，其较硅胶而言保留含不饱和键的极性干扰物的能力更强[16]。由于MOSH是由正构烷烃、支链烷烃和环烷烃组成的复杂化合物体系，本文通过添加1.2中正构烷烃n-C8-C40混标和食品级白矿物油(由支链烷烃和环烷烃组成，碳链数在n-C13-C38之间)混标溶液，考察质量分数为0.3%、1%和10%的3种不同配比的硝酸银硅胶填料对MOSH的回收率的影响。由图2可以看出3种配比的硝酸银硅胶对MOSH的回收率影响不显著，均可用于面包中MOSH的分离。虽然硝酸银比例的增加可进一步确保MOSH与干扰物的分离度，但硝酸银含量越大操作过程中对避光的要求越高，因此实验最终选择1%的硝酸银硅胶作为萃取填料。

图2　三种硝酸银硅胶SPE柱分离MOSH的GC-FID谱图Fig. 2　GC-FID chromatograms of MOSH separation by three silver-silica gel SPE columns

2.2.2硝酸银硅胶柱洗脱体积的测试

通过添加1.2中正构烷烃n-C8-C40混标和食品级白矿物油混标工作溶液于空白面包样品中，考察了质量分数为1%的硝酸银硅胶填料上正己烷洗脱体积对MOSH回收率的影响(图3)。

图3　洗脱体积对MOSH的影响Fig. 3　Effects of elution volume on MOSH separation

由图3可以看出，当用1 mL正己烷洗脱时，n-C8-C40正构烷烃以及食品级白矿物油的回收率相对较低，为14%～80%；当用2 mL正己烷洗脱时，n-C8-C40正构烷烃以及食品级白矿物油的回收率有所增加，为37%～101%；当用3 mL正己烷洗脱时，其回收率与2 mL正己烷洗脱时并无显著差异，但随着洗脱量的增大，基质中存在的弱极性的干扰物会随之流出，因此在保证回收率的前提下选择2 mL正己烷洗脱液。值得一提的是，由于碳链较短的正构烷烃的沸点较低，前处理过程较易挥发，故采用正己烷洗脱时n-C8-C12正构烷烃的回收率较低(37%～50%)，而恰巧此部分MOSH并不是关注的重点，重点在于碳链数在n-C16-C35之间的烷烃[3]。因此采用1%硝酸银硅胶柱用2 mL正己烷洗脱即可将MOSH从面包基质中分离开来，同时碳链数在n-C16-C35之间的MOSH的回收率可达89%～98%。

2.3色谱分析条件及定量方法的确定

2.3.1色谱分析条件的确定

要想获得较高的仪器灵敏度(即基线上方的驼峰的高度最高)，必须使用较高的升温速率，但亦不可过高以免造成较大的柱流失[13]。实验过程中比较了20℃/min和40℃/min的升温速率(如图4所示)，在非极性DB-1色谱柱上，采用40℃/min的速率时的信噪比较20℃/min时高一倍左右，一定程度上可提高仪器的检测灵敏度。

图4　不同柱升温速率对饱和烃类矿物油出峰的影响Fig.4　Effect of different column temperature program

2.3.2MOSH定量方法的确定

烃类矿物油包括很多物质，且每种样品中的矿物油种类相差较大。大多情况下矿物油中每种物质的校正因子较难获得，因此寻找一种对所有矿物油具有相似响应的检测器尤为重要。在这方面，MS不及FID，其对不同烃类物质的响应不同，而FID对所有的饱和烃类的响应基本一样，可以在不需要校正因子的情况下使用单个的烃类作为内标或烃类混合物作为外标进行定量[17]。

目前对于MOSH的定量可采用食品级白矿物油作为标准品，外标法进行定量[10]。在对色谱图中的驼峰进行积分时应注意以下几点：

(1)每次进样之前需多次进空白溶剂以确保基线足够平稳且无杂质干扰[13]。

(2)根据分子质量分布对驼峰进行分割：一般认为低于n-C24的MOSH较易发生迁移，高于n-C35的MOSH难以从食品接触材料向食品迁移且不易在人体内累积[3]，因此普遍以对应的正构烷烃为界限将其分为两段，即n-C16-C24之间的MOSH为高挥发性的烃类矿物油物质、n-C24-C35之间的为低挥发性烃类矿物油物质。

(3)根据分子质量分布对MOSH驼峰积分：参照BIEDERMANN等人的积分方法，先将整个驼峰的峰面积积分，再减去食品中内源性奇数碳正构烷烃的峰面积即可[10]。

2.4方法的基本性能

2.4.1线性范围及测定低限

将食品级白矿物油标准储备液逐级稀释为3.0、10.0、50.0、100.0、200.0 mg/kg的系列混合标准工作溶液，在1.5条件下进样测定，以被测物峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，得出线性方程和相关系数，食品级白矿物油在3.0～200.0 mg/kg内呈良好的线性关系(Y=19 880x+49 929，R2=0.999 1)。将一定质量浓度标准品添加到阴性样品中，以3倍信噪比作为分析方法的测定低限，实际测定低限为1.0 mg/kg；以10倍信噪比时作为分析方法的定量低限，实际定量限为3.0 mg/kg。

2.4.2回收率实验

在阴性面包基质中添加食品级白矿物油标准储备溶液进行回收率实验，添加水平为3.0、50.0、150.0 mg/kg，按照选定的实验条件测定，每个水平平行测定6 次，结果见表1。结果表明：在以上3 个添加水平下，回收率范围为90.4%～105.1%，相对标准偏差(RSD)范围为3.29%～5.77%，该方法的回收率和RSD均符合检测要求[18]。若在实际样品检测中其浓度有超出线性范围的情况，可将样品溶液稀释至线性范围之内再进行测定。

表1　食品级白矿物油的回收率及其精密度(n= 6)

2.5实际样品分析

采用上述方法对10个市售面包样品进行检测，测定结果见表2。可以看出除了面包5之外，其余面包中MOSH(n-C16-C24)含量在10.1～101.4 mg/kg之间，MOSH(n-C24-C35)含量在4.2～71.3 mg/kg之间。其中面包1中的MOSH含量最高，MOSH(n-C16-C24)含量为101.4 mg/kg，MOSH(n-C24-C35)含量为71.3 mg/kg(见图5)，其污染原因可能是其生产过程中使用含矿物油的脱模剂和防粘剂的的缘故，也可能是包装材料上的矿物油的迁移所致[3]。然而国内暂无MOSH在面包中的最大使用限量，仅GB 2760—2014[19]中规定在除胶基糖果以外的其他糖果和鲜蛋中用于被膜剂的食品级白矿物油(一种MOSH产品)的最大使用量为5 g/kg，因此国内面包中存在的高含量MOSH应引起一定的关注。

表2　不同面包中的MOSH含量　　单位：mg/kg

图5　面包1中MOSH的GC-FID谱图Fig. 5　GC-FID chromatograms of MOSH in bread 1

3　结论

本文建立了面包中饱和烃类矿物油(MOSH)的硝酸银硅胶固相萃取GC-FID的分析方法，通过正己烷提取，质量分数为1%的硝酸银硅胶净化，在优化的色谱条件下可以实现面包中MOSH的分离与定量，方法的检出限为1 mg/kg，定量限为3 mg/kg。与自动在线技术相比，本方法操作简单、成本低。

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Research on the determination of mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) in bread by SPE-GC-FID

AN Hong-mei1，KE Run-hui1*，LIU Xiu1，TIAN Fei-fei2，WANG Li-juan1,HUANG Xin-Wang1，YIN Jian-jun1

1(China national research institute offood&fermentation industry, Beijing 100015, China) 2(Shimadzu(China)Co.Ltd, Beijing 100020, China)

A method for the determination of mineral oil saturated hydrocarbons(MOSH) in bread samples by silver nitrate -silica gel SPE-GC-FID was established. The limits of detection and quantification of this method were 1.0mg/kg and 3.0mg/kg under the optimizing pretreatment and instrument conditions. Satisfactory linearity was obtained with a correlation coefficient of 0.9991 and Spiked recoveries range of 90.4%～105.1% with RSD of 3.29%～5.77% (n=6). The most contaminated sample was a bread with 101.4 mg/kg of MOSH between n-C16and n-C24and 71.3 mg/kg of MOSH between n-C24and n-C35. The method can be applied to determine mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) in bread samples for its efficiency and simplicity.

mineral oil saturated hydrocarbons(MOSH);bread samples;gas chromatography-flame ionization detector (GC-FID);silver nitrate-silica gel solid phase extration

硕士,工程师(柯润辉博士为通讯作者)。

2015-02-28，改回日期：2015-05-05

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601029