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苏黄止咳胶囊对咳嗽变异性哮喘豚鼠模型疗效的实验研究

2016-09-26张忠德高明李际强刘云涛李洪涛

广州中医药大学学报 2016年5期
关键词:苏黄豚鼠泼尼松

张忠德,高明,李际强,刘云涛,李洪涛

(1.广州中医药大学第二附属医院,广东广州 510120;2.广州中医药大学2014级硕士研究生,广东广州 510405;3.广州医科大学附属第一医院呼吸疾病国家重点实验室,广东广州 510230)

苏黄止咳胶囊对咳嗽变异性哮喘豚鼠模型疗效的实验研究

张忠德1,高明2,李际强1,刘云涛1,李洪涛3

(1.广州中医药大学第二附属医院,广东广州510120;2.广州中医药大学2014级硕士研究生,广东广州510405;3.广州医科大学附属第一医院呼吸疾病国家重点实验室,广东广州510230)

【目的】 观察苏黄止咳胶囊对咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma,CVA)豚鼠模型的疗效,探讨苏黄止咳胶囊的作用机制。【方法】将50只豚鼠随机分成正常对照组、模型对照组、醋酸泼尼松组及苏黄止咳胶囊高、低剂量组,复制CVA豚鼠模型,检测各组豚鼠咳嗽反应、肺组织病理学、支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸粒细胞百分率及血清中白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IgE的水平变化。【结果】与正常对照组比较,模型对照组豚鼠咳嗽次数显著增多(P<0.05);与模型对照组比较,苏黄高剂量组咳嗽次数显著减少(P<0.05)。与正常对照组比较,模型对照组BALF中嗜酸性粒细胞百分率显著上升(P<0.05);3个治疗组嗜酸性粒细胞百分率均较模型组显著降低(P<0.05)。治疗组肺组织病理改变较模型对照组减轻。与正常对照组比较,模型对照组血清中IL-4、TNF-α、IgE水平显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,醋酸泼尼松组血清中IL-4、TNF-α水平显著下降,苏黄高剂量组血清中TNF-α、IgE水平显著下降(P<0.05)。【结论】苏黄止咳胶囊可能通过降低血清中TNF-α和IgE的水平,改善CVA豚鼠的咳嗽症状、气道炎症及肺组织病理变化,从而达到治疗CVA的目的。

苏黄止咳胶囊;咳嗽变异性哮喘;细胞因子;肺/病理学;疾病模型,动物;豚鼠

咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma,CVA)主要表现为反复不断的干咳为主,伴有咽喉部发痒感,偶有难咳出的少量的白痰,咳嗽一般呈阵发性、挛急性,剧烈咳嗽时可伴有气急、气不得续,亦有“语言不得竞”等症状,甚至有的患者以夜间剧烈咳嗽为主,严重影响睡眠[1]。全国名老中医晁恩祥教授针对咳嗽变异性哮喘研制了苏黄止咳胶囊,临床上获得满意的临床疗效[2-3]。本研究从CVA豚鼠的咳嗽反应、肺组织病理学、支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸粒细胞百分率及血清中白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、免疫球蛋白(IgE)的水平变化,探讨苏黄止咳胶囊治疗CVA的疗效及可能的作用机制,现报道如下。

1 材料和方法

1.1实验动物普通级雌性豚鼠50只,体质量(300±50)g,由南方医科大学实验动物中心提供,合格证号:44002100006813。

1.2实验试剂与仪器鸡卵清白蛋白(OVA)溶液(OVA购自美国GBCBIO Technologies公司):将1 g鸡卵清白蛋白干粉溶于25 mL的生理盐水中先配置成40 g/L OVA溶液,并用生理盐水稀释20 g/ L OVA溶液;氢氧化铝干粉(购自天津惠瑞化工科技有限公司,批号:20141111);辣椒素溶液:取辣椒素(购自美国Sigma公司)30.5 mg,依次加入吐温-80溶液及无水乙醇各1 mL溶解,再加入生理盐水8.0 mL,配成10-2mol/L的辣椒素原液,取1 mL的辣椒素原液,稀释至100 mL成10-4mol/L溶液;IL-4酶联免疫试剂盒(购自武汉华美公司);IFN-γ、TNF-α酶联免疫试剂盒(购自美国LifeSpan公司)。1205型压缩雾化吸入机(德国PARI公司);1.0LPM小动物无创肺功能仪(美国DSI BUXCO公司);FinePointe气道阻力和肺顺应性检测系统(RC系统)(美国DSI BUXCO公司)。

1.3实验药物苏黄止咳胶囊(由麻黄、紫苏叶、地龙、蜜枇杷叶、炒紫苏子、蝉蜕、前胡、炒牛蒡子、五味子等组成),成人用量每次3粒,每日3次,每粒0.45 g。生产批号:15060312。

1.4模型制作与分组实验动物随机分为正常对照组,模型对照组,苏黄止咳胶囊高、低剂量组,醋酸泼尼松组。造模组动物在第1~28天,每天熏烟半小时;第15天每只豚鼠注射20 g/L OVA 1 mL和200 mg氢氧化铝的混悬液;第22天每只豚鼠注射20 g/L OVA 1 mL和200 mg氢氧化铝的混悬液加强致敏1次;第29天用10 g/L OVA雾化攻击,连续7 d,每天1次;正常对照组给予相同体积的生理盐水。所有动物饲养在普通环境,12 h/ 12 h光照循环,自由饮水和食用颗粒饲料。

熏烟箱及使用方法:熏烟箱为定制的长、宽、高分别为100 cm×60 cm×60 cm的不锈钢箱体。本研究所用香烟为“红梅”过滤嘴香烟(红塔烟草有限责任公司;烤烟型香烟,焦油量10 mg,烟气烟碱量0.7 mg,烟气一氧化碳量12 mg)。每次在熏烟箱中点燃10根香烟,将香烟点燃后,通过300 mL注射器和三通管的人工操作将烟雾排入熏烟箱,直至香烟燃完。

1.5给药在第29天雾化攻击当天开始给药,给药剂量:苏黄止咳胶囊高剂量组为6 g/kg,低剂量组为2 g/kg,醋酸泼尼松组为3 mg/kg。灌胃给予相应的药物,每天1次,连续7 d。正常对照组和模型对照组给予相同体积的生理盐水。

1.6观察指标

1.6.1咳嗽敏感性的测定(CRS)[4-6]通过辣椒素咳嗽激发试验判断气道的咳嗽敏感性。采用全身体积描记法(Buxco Electronics),10 g/L OVA最后1次雾化攻击后的第2天,将豚鼠放入体描箱内,用10-4mol/L辣椒素溶液雾化2 min后观察并记录豚鼠5 min的咳嗽次数。

1.6.2支气管肺泡灌洗液的收集和支气管肺泡灌洗液中白细胞计数分类待激发试验完成后,支气管肺泡灌洗3次,每次2 mL磷酸盐缓冲液(PBS),并回收支气管肺泡灌洗液(BALF)。将收集的BALF取200 μL,并以3 000 r/min离心10 min;转移上清液,加入红细胞裂解液后,3 000 r/min离心10 min;转移上清液,加入等量PBS涂片,苏木精—伊红(HE)染色;在显微镜下计连续视野中每200个细胞中嗜酸性粒细胞的数量,并计算出嗜酸性细胞的百分率。将收集的BALF取100 μL,以3 000 r/min离心10 min;转移上清液,加入红细胞裂解液后,再以3 000 r/min离心10 min;加入等量PBS,取10 μL进行细胞计数。其余BALF离心后取上清,-80℃保存备用。

1.6.3酶联免疫吸附法测定豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、TNF-α、IgE的含量采用腹主动脉采血法,采血5 mL放入促凝管,静置后离心(3 000 r/min)10 min,分离血清,检测IL-4、IFN-γ、TNF-α、IgE含量。测定方法严格按照试剂盒说明书操作。

1.6.4肺组织病理学观察常规固定、石蜡切片、HE染色,在显微镜下观察气管的组织学病理情况。

1.7统计方法采用SPSS 17.0统计软件进行分析,数据以均数 ±标准差(±s)表示,采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,以 P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组豚鼠CRS测定表1结果显示:与正常对照组比较,模型组咳嗽次数显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);治疗组的咳嗽次数显著低于模型组,苏黄高剂量组的咳嗽次数与模型对照组和苏黄低剂量组比较显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);3个治疗组之间比较,表明苏黄止咳胶囊能抑制豚鼠的咳嗽反应,具有镇咳的作用,止咳的效果与苏黄止咳胶囊的剂量有一定的关系。

表1 各组豚鼠咳嗽次数比较Table 1 Comparison of cough frequency of guinea pigs of different groups (±s)

表1 各组豚鼠咳嗽次数比较Table 1 Comparison of cough frequency of guinea pigs of different groups (±s)

①P<0.05,与正常对照组比较;②P<0.05,与模型对照组比较;③P<0.05,与苏黄低剂量组比较

组别正常对照组模型对照组醋酸泼尼松组苏黄低剂量组苏黄高剂量组N 8 8 8 9 8 n咳嗽/(次·min-1)0.66±0.50 3.03±0.91①2.20±0.96 2.96±1.32 1.33±0.77②③

2.2各组豚鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞百分率的测定表2结果显示:与正常对照组比较,模型对照组的嗜酸性粒细胞百分率显著上升,差异有统计学意义(P<0.05);与模型对照组比较,3个治疗组嗜酸性粒细胞百分率显著下降,差异均有统计学意义(P<0.05);3个治疗组之间比较,醋酸泼尼松组嗜酸性粒细胞百分率下降明显,与苏黄低剂量组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组豚鼠BALF中嗜酸性粒细胞百分率比较Table 2 Comparison of the percentage of eosinophils in BALF of guinea pigs of different groups (±s)

表2 各组豚鼠BALF中嗜酸性粒细胞百分率比较Table 2 Comparison of the percentage of eosinophils in BALF of guinea pigs of different groups (±s)

①P<0.05,与正常对照组比较;②P<0.05,与模型对照组比较;③P<0.05,与苏黄低剂量组比较

组别正常对照组模型对照组醋酸泼尼松组苏黄低剂量组苏黄高剂量组N 8 8 6 7 6 p嗜酸性粒细胞/% 0.04±0.01 0.23±0.03①0.09±0.06②③0.14±0.03②0.12±0.03②

2.3各组豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、TNF-α和IgE水平的检测结果表3结果显示:与正常对照组比较,模型对照组IL-4、TNF-α、IgE水平均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型对照组比较,醋酸泼尼松组可显著降低IL-4、TNF-α的水平,苏黄高剂量组可显著降低TNF-α、IgE的水平,差异均有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、TNF-α和IgE含量的检测结果比较Table 3 Comparison of serum IL-4,IFN-γ,TNF-α and IgE of guinea pigs of different groups (±s)

表3 各组豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、TNF-α和IgE含量的检测结果比较Table 3 Comparison of serum IL-4,IFN-γ,TNF-α and IgE of guinea pigs of different groups (±s)

①P<0.05,与正常对照组比较;②P<0.05,与模型对照组比较;③P<0.05,与苏黄高剂量组比较

组别正常对照组模型对照组醋酸泼尼松组苏黄低剂量组苏黄高剂量组N 6 6 6 6 6 ρIL-4/(pg·mL-1)7.64±3.69 18.95±10.40①2.93±1.67②③17.67±3.98 12.80±9.38 ρIFN-γ/(pg·mL-1)165.92±66.10 146.77±34.92 162.76±19.84 174.76±58.05 190.66±16.25 ρTNF-α/(pg·mL-1)15.12±5.92 25.01±11.16①15.36±3.31②19.75±2.83 16.48±3.31②ρIgE//(mg·L-1)33.58±2.10 59.85±8.87①70.47±5.90 62.80±9.67③47.26±10.80②

2.4各组豚鼠肺组织病理学图1结果显示:正常对照组肺组织黏膜上皮正常,管腔内脱落细胞少,大部分管腔内无脱落细胞;模型对照组肺组织管腔内有脱落细胞,黏膜层不完整,细支气管杯状细胞增生,平滑肌肥厚,管壁增厚,管周较多嗜酸性粒细胞浸润,邻近肺组织、肺泡腔内可见组织细胞及中性粒细胞渗出,肺间隔较多嗜酸性粒细胞及少许淋巴细胞浸润,血管壁增厚;醋酸泼尼松组肺组织管腔内少量脱落细胞,管腔内少量的黏性分泌液,少量炎性细胞浸润;苏黄低剂量组肺组织细支气管腔不规则,管周少量淋巴细胞及个别嗜酸性粒细胞浸润,肺组织腔内见少量炎性渗出物,间质有嗜酸性粒细胞浸润;苏黄高剂量组肺组织管腔内少量脱落细胞,管周嗜酸性粒细胞浸润,血管壁增厚。

3 讨论

咳嗽变异性哮喘(CVA)临床表现为阵发性、刺激性干咳,遇冷空气、灰尘、油烟等容易诱发或加重咳嗽,常伴有咽痒等症。晁恩祥教授根据其临床特点,认为与中医单纯外邪犯肺,肺失宣肃,气逆而咳不同,亦与哮喘宿痰伏肺有别;该咳嗽的病因与“风邪”相关,与风性“善行而数变”、“风盛则痒”、“风盛则挛急”相符,属于“风咳”的范畴;其病因病机为风邪犯肺,邪阻肺络,肺气失宣,肺管不利,气道挛急所致,据此创立从风论治的治疗大法,以“疏风宣肺,解痉止咳”为法,研制了苏黄止咳胶囊,临床上对患者咳嗽、咽痒、气急等症状有显著疗效[7-8]。药理学试验表明,苏黄止咳胶囊具有止咳、平喘、祛痰、抗气道炎症和调节免疫的作用[9]。

图1 各组豚鼠肺组织病理形态比较(HE染色,×100)Figure 1 Pathological changes in guinea pig lung tissues of different groups(by HE staining,×100)

目前认为在CVA发病过程中,IgE介导的Ⅰ型变态反应起了主要作用,以嗜酸性粒细胞浸润为主的变应性气道炎症是CVA的主要病理基础[10],模型对照组豚鼠BALF中嗜酸性粒细胞百分率显著升高,给予治疗后中药组和醋酸泼尼松组有所下降,并且苏黄高剂量组相对于苏黄低剂量组下降明显,表明苏黄止咳胶囊可以减轻嗜酸性粒细胞的浸润状况,但醋酸泼尼松效果更理想。长期气道慢性非特异性炎症的刺激,出现不同程度的气道黏膜上皮损伤、纤毛脱落和炎性细胞浸润、气道黏膜水肿与肥厚和气道内炎性分泌物阻塞等一系列的病理改变[11]。与模型对照组比较,各治疗组肺组织病理变化得到改善。而气道上皮受损脱落,会导致上皮下的迷走神经末梢暴露,容易接受物理或化学等微小的刺激激惹,使CVA患者咳嗽敏感性升高[12]。CRS的测定是通过雾化吸入特异性的刺激物,激活气道感觉神经末梢的咳嗽感受器,诱发咳嗽的产生,以激发物的浓度和咳嗽程度判断CRS。辣椒素是红辣椒的刺激成分提取物,因为其安全、剂量依赖性和重复性好,所以很适合用作CRS的评价[13]。本研究中造模组的豚鼠咳嗽次数显著升高,说明造模是成功的,而经过中药和醋酸泼尼松治疗的豚鼠的咳嗽次数明显减少,并且苏黄高剂量组豚鼠的咳嗽次数较醋酸泼尼松组少,表明苏黄止咳胶囊能有效缓解豚鼠的咳嗽症状,并与苏黄止咳胶囊的剂量有一定的相关性。

诸多证据表明,免疫功能紊乱在CVA发病机制中起重要作用。TH1/TH2失衡尤其是TH1下降,可导致大量炎性介质生成,造成慢性气道炎症。TH1细胞亚群主要分泌IFN-γ,介导细胞免疫应答和迟发型变态反应;TH2细胞亚群主要产生IL-4等细胞因子,可诱导嗜酸性粒细胞的产生和聚集,辅助B细胞产生IgE等,介导体液免疫应答及Ⅰ型变态反应[14]。TNF-α是各种细胞因子的启动因子,促进炎性细胞的浸润和活化,具有广泛的生物活性,能够刺激炎症细胞释放各种炎性介质,Brightling等[15]研究证实CVA患儿血清TNF-α较健康儿童显著升高,说明TNF-α的释放是CVA发病的重要机制之一。本研究选择了代表TH1型细胞因子IFN-γ和TH2型细胞因子IL-4,以及TNF-α、IgE来观察苏黄止咳胶囊治疗豚鼠模型的免疫作用机制,实验结果表明:模型对照组中IL-4水平显著升高,治疗组IL-4水平下降,醋酸泼尼松组效果较为显著;模型对照组IFN-γ水平下降,经过治疗,苏黄高剂量组上升明显,但无统计学意义;模型对照组TNF-α水平显著升高,醋酸泼尼松组与苏黄高剂量组显著降低TNF-α水平;模型对照组IgE水平升高,苏黄高剂量组IgE水平显著低于模型对照组。由于经费有限,每一组随机选取6个样本,样本数目相对较少,实验操作中仍会存在一定的误差,相关数据尚需通过进一步实验再次验证。

本研究应用苏黄止咳胶囊干预后,可以显著改善豚鼠的咳嗽症状,肺组织学病理改变较模型对照组显著减轻,BALF中嗜酸性粒细胞百分率及血清中TNF-α、IgE水平降低,提示苏黄止咳胶囊对CVA豚鼠有治疗作用,其作用机制可能与降低血清中的TNF-α、IgE的含量,从而调节TH1与TH2的平衡状态,减轻嗜酸性粒细胞浸润,减轻气道炎症有关。IFN-γ在CVA发病过程中起重要作用,药物是否通过升高IFN-γ的水平而达到治疗CVA目的,尚需进一步证实。

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【责任编辑:黄玲】

Experimental Study of Therapeutic Effect of Suhuang Zhike Capsules for Guinea Pig Model with Cough Variant Asthma

ZHANG Zhongde1,GAO Ming2,LI Jiqiang1,LIU Yuntao1,LI Hongtao3
(1.The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510120 Guangdong,China;2.Postgraduates Enrolled in 2014,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405 Guangdong,China;3.The State Key Laboratory of Respiratory Disease of the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510230 Guangdong,China)

ObjectiveTo observe the effects of Suhuang Zhike capsules(SZC)on theguinea pig model of cough variant asthma(CVA),and to explore its therapeutic mechanism.Methods Fifty guinea pigs were randomly divided into normal control group,model group,prednisone acetate tablets group,and high-and low-dose SZC groups.With reference to the related literatures,we set up the guinea pig model of CVA.The observation indexes included cough frequency,lung histopathology,the percentage of eosinophils in bronchoalveolar lavage fluid (BALF),and the serum levels of interleukin 4(IL-4),interferon gamma(IFN-γ),tumor necrosis factor alpha (TNF-α),and immunoglobumin E(IgE).Results Compared with the normal control group,the cough frequency of the model group was significantly increased(P<0.05);compared with the model group,the cough frequency of high-dose SZC group was reduced obviously(P<0.05).Compared with the normal control group,the percentage of eosinophils in BALF of the model group was significantly increased(P<0.05);the percentage of eosinophils of the three medication groups was lower than that of the model group(P<0.05).The pathologicalchanges of lung tissue in the medication groups were relieved compared to the model group.Compared with the normal control group,the serum IL-4,TNF-α and IgE levels of the model group were increased significantly (P<0.05);compared with the model group,the serum IL-4 and TNF-α levels of prednisone acetate tablets group were significantly decreased,and the serum TNF-α and IgE levels of high-dose SZC group were decreased significantly(P<0.05).Conclusion SZC could reduce the serum,TNF-α and IgE levels,and relieve the cough symptom,airway inflammation and the lung tissue pathology in CVA guinea pig,so as to achieve the therapeutic effect on CVA.

SuhuangZhikecapsules;coughvariantasthma;cytokines;lung/pathology;diseasemodels,animal;guinea pigs

R285.5

A

1007-3213(2016)05-0693-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.05.018

2016-04-27

张忠德(1964-),男,主任医师,博士研究生导师;E-mail:doctorzzd99@163.com

李际强(1972-),男,主任中医师;E-mail:1728183346@qq.com

广东省自然科学基金资助项目(编号:S2013010012179、2014A030313412)

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