白簕提取物抑制痤疮丙酸杆菌及美白活性研究

劳景辉，潘超美，喻勤，倪庆桂，孙忠伟，郁晓艺

[1.广州中医药大学，广东 广州 510006；2.完美(中国)有限公司，广东 中山 528402]

白簕提取物抑制痤疮丙酸杆菌及美白活性研究

劳景辉1，2，潘超美1*，喻勤2，倪庆桂2，孙忠伟2，郁晓艺2

[1.广州中医药大学，广东 广州510006；2.完美(中国)有限公司，广东 中山528402]

目的：对白簕提取物的抑制痤疮丙酸杆菌和美白活性进行研究，评价白簕提取物的生物活性强弱。方法：以测定最小抑菌浓度(MIC)来评价白簕提取物抑制痤疮丙酸杆菌生长的活性；以抑制B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶能力，测定其美白活性。结果：白簕醇提物和水提物抑制痤疮丙酸杆菌的MIC值分别为2.5mg·mL-1和5mg·mL-1；白簕水提物对酪氨酸酶抑制活性较好，但醇提物未发现该活性。结论：白簕醇提物具有良好的抑制痤疮丙酸杆菌活性，而水提物的活性则表现在抑制酪氨酸酶中。

白簕；提取物；抑制痤疮丙酸杆菌；美白活性

白簕Eleutherococcustrifoliatus(Linnaeus) S.Y.Hu又名三加皮、刺三加和三叶五加等，为五加科(Araliaceae A.L.Jussieu)五加属(EleutherococcusMaxim)攀援状灌木，广泛分布于我国贵州、四川、广西、广东、台湾和海南等南方省份以及泰国、越南和马来西亚等东南亚国家。在广东省江门地区，人们广泛应用白簕作为止痒清毒的民间草药已有很长的历史[1]，而在实验研究中也发现，白簕具有显著的抗炎抑菌活性[2-3]，这提示白簕可能有较好的消肿止痒功效，如抗痤疮等。为了进一步发掘白簕的新功能和活性，本实验以白簕水提物和醇提物为实验材料，分别测定其对痤疮丙酸杆菌的MIC(最小抑菌浓度)值，确定白簕对痤疮丙酸杆菌的抑制效果，推测其抗痤疮活性；同时以小鼠B16黑色素瘤细胞为受试细胞，分别测定白簕醇提物和水提物对细胞内酪氨酸酶的抑制效果，探讨白簕对B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的影响，初步确定白簕的体外美白活性。

1 材料

1.1实验菌株及细胞株

痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes，广东省微生物研究所，编号：ATCC11827)；小鼠B16黑色素瘤细胞株(中国科学院上海细胞库)。

1.2材料与试剂

实验材料：白簕采自广东省恩平雪壮白簕基地，经广州中医药大学药用植物学教研室主任潘超美教授鉴定为五加科植物白簕Eleutherococcustrifoliatus(Linnaeus) S.Y.Hu的茎和叶。

改良GAM琼脂基础(北京陆桥技术有限公司，批号：1301082)；改良GAM肉汤(珠海维特生物技术有限公司，批号：20121229)；RPMI-1640培养基(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)；胎牛血清(Gibco/Life Technologies)；0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco/Life Technologies)；DMSO(细胞级，Sigma-Aldrich公司)；L-多巴(Sigma公司)；熊果苷(Sigma公司)；Triton X-100(Sigma公司)；水为超纯水，其余试剂为分析纯。

1.3仪器与设备

SHIMADZUUV-2550紫外可见分光光度仪[岛津(香港)有限公司]；ESCO/AC2-S生物安全柜(新加坡艺思高科技有限公司)；CH2-TKC-3倒置显微镜(广东光学仪器有限公司)；2406型细胞培养箱(美国SHELLAB公司)；InfiniteF200型多功能酶标仪(奥地利TECAN公司)；Eppendorf移液枪、Bio-DL排枪和CorningIncorporated/Nest细胞耗材等。

2 方法

2.1药材预处理及提取物制备

采集新鲜白簕，取用顶端幼嫩茎叶部分，洗净，阴干后置于烘箱干燥过夜。粉碎干燥后的白簕，过10目筛，备用。醇提物制备：称取干燥粉碎后的白簕300g，置于圆底烧瓶中，加入10倍量(W/V)95%乙醇回流提取2次，每次1.5h，滤过(180目筛)，合并滤液。减压浓缩(60℃)，约1.5h/次，合并多次浓缩液后，再统一浓缩约2h，浓缩浸膏供真空干燥用。将上述浓缩浸膏倾倒于托盘内，真空干燥约10h(55℃，真空度≥-0.1MPa)。将托盘内提取物刮下，研碎，过80目筛。水提物制备：称量干燥粉碎后的白簕300g，置于圆底烧瓶中，加入12倍量(W/W)水，回流提取2次，每次1.5h，滤过(180目筛)，合并滤液。采用喷雾干燥方式直接喷干。

2.2测定白簕提取物抑制痤疮丙酸杆菌的MIC值

2.2.1样品溶液的制备 分别称取白簕水提物和醇提物。用无菌水溶解，各配得0.1g·mL-1(生药浓度)100mL溶液。用无菌滤膜分别将溶液过滤除菌，滤液待用。

2.2.2菌种活化 将痤疮丙酸杆菌转接到改良GAM琼脂上，37℃厌氧培养2d，使菌活化繁殖。

2.2.3菌悬液的制备 用接种环挑取痤疮丙酸杆菌菌体，放入100mL无菌水中，充分振荡10min，制成菌体悬液。将菌悬液倒入比色杯中，选用600nm波长，以无菌水作为空白对照，采用比浊法测定菌悬液的浓度，调整菌悬液浓度使每次所用菌悬液浓度基本保持一致。

2.2.4MIC值的测定 在灭菌后的改良GAM肉汤中分别加入等体积无菌水、双抗和已过滤除菌的样品溶液，作为阴性对照、阳性对照和实验组，其中实验组各试管的药液浓度按生药量算，见表1。分别接入已多次活化的等量菌悬液，密封，编号，37℃下静置培养48h，取样测定培养基的吸光度(OD)值(600nm波长)，并以不接入菌悬液的作为实验对照组，得出最小抑菌浓度(MIC)。

表1 抑制痤疮丙酸杆菌实验各组试管组成及加入量

表1(续)

注：各管分别做3个重复；2号及14～23号管不加入菌液，其余各管加入等量菌液。

2.3白簕提取物对B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的影响2.3.1 样品溶液的制备 同2.1。再将醇提物溶液和水提物溶液用RPMI-1640液体培养基分别稀释成10、8、6、4、2 mg·mL-1的生药浓度。

2.3.2 小鼠B16黑色素瘤细胞的培养 在无菌条件下，将1105个·mL-1的小鼠B16黑色素瘤细胞接种于含RPMI-1640液体培养基的培养皿中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每3 d用0.25 %胰酶消化传代1次。

2.3.3 测定白簕提取物对B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制率 取对数生长期的黑色素瘤B16细胞，将细胞悬液调整至细胞浓度为2×104个·mL-1后，接种于96孔培养板，每孔180 μL。实验设置空白对照组、阴性对照组和实验组。种板时，空白对照组只加细胞培养液、其他组都加细胞悬液。在5% CO2、37 ℃孵育24 h，待细胞贴壁后，分别加入20 μL上述不同浓度的醇提物溶液和水提物溶液，每个浓度设3个重复，使终浓度为加入时的1/10，培养72 h。弃培养基，用磷酸缓冲液(PBS)润洗2次，每孔加入1% TritonX-100溶液100 μL，迅速放入-80 ℃低温冰箱冻存30 min。室温下融化使得细胞完全破裂。37 ℃预温后加入1%左旋多巴溶液(用PBS稀释，使其pH<7)20 μL，37 ℃反应2 h后，测定490 nm处吸光度值。以终浓度为200 μg·mL-1的熊果苷为阳性对照，培养液为阴性和空白对照[4-5]。

酪氨酸酶活性抑制率=[(阴性对照组平均吸光度值-实验组平均吸光度值)/(阴性对照组平均吸光度值-空白对照组平均吸光度值)]×100

3 结果与分析

3.1白簕醇提物抑制痤疮丙酸杆菌的MIC值

由表2、3可知，白簕醇提物在生药浓度为10、5、2.5 mg·mL-1时，其菌体OD600的吸光度与阴性对照组相比，均有统计学差异，表明在这些浓度下，醇提物具有较好的抑菌效果，而在生药浓度为1.25 mg·mL-1时，其菌体OD600的吸光度与阴性对照组相比，P>0.05，表明该浓度下，药物的抑菌能力下降，与阴性对照组的差异无统计学意义，所以白簕醇提物抑制痤疮丙酸杆菌的MIC值为生药浓度2.5 mg·mL-1。另外，在进行预实验时，由于样品的颜色较深，对测定吸光度有较大影响，因此，在正式实验中，除了醇提物和水提物实验组外，还增加了相应的实验对照组，主要用于排除样品本身对测定的影响，使实验结果更准确。

表2 阴性组、空白组和阳性组的

注：(1)菌体OD600是指扣除空白对照，即菌体的吸光度；(2)与阴性组相比较，*P<0.05，下同。

表3 白簕醇提物实验组的

注：菌体OD600是指扣除醇提物实验对照，即菌体的吸光度。

3.2白簕水提物抑制痤疮丙酸杆菌的MIC值

由表4可知，白簕水提物也有较好的抑菌效果，在生药浓度为5mg·mL-1时，其抑菌效果较好，菌体OD600与阴性组比较，有统计学差异，但在5mg·mL-1以下的浓度，则没有明显的抑菌效果，因此，白簕水提物抑制痤疮丙酸杆菌的MIC值为生药浓度5mg·mL-1。

表4 白簕水提物实验组的

注：菌体OD600是指扣除水提物实验对照，即菌体的吸光度。

3.3白簕醇提物在B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制率 白簕醇提物在本实验中，未发现有酪氨酸酶抑制活性，可能各提取部位中所含的活性成分对不同活性作用效果有差异，在后续研究中将继续进行探讨。

3.4白簕水提物在B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制率 结果见表5。实验发现，白簕水提物具有较好的酪氨酸酶抑制活性，其抑制效果随作用浓度的增大而增强，显示出一定的剂量依赖性，在生药质量浓度为800 μg·mL-1(即提取物质量浓度约为225.36 μg·mL-1)时，其酪氨酸酶抑制率与200 μg·mL-1熊果苷对照组相当。

表5 白簕水提物对B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制率

注：水提物实验组的终浓度按生药量计算。

4 讨论

对于白簕抗痤疮的研究不多，仅有报道白簕对同为皮肤常见菌——金黄色酿脓葡萄球菌的抑制作用，利用滤纸片法测得白簕甲醇提取物对该菌的抑菌圈为11.5mm，与香菇草和铁包金等抑菌活性相当[6]，但未见白簕对痤疮丙酸杆菌的抑制研究报道，由于痤疮丙酸杆菌是痤疮发病的重要诱因之一，因此，对其的抑制研究更有利于白簕抗痤疮功效的评估。

另外，具有清热解毒、与白簕有类似功效的其他中药，如黄芩和金银花等，也有对痤疮丙酸杆菌的抑制研究报道。郑景峰[7]报道其测得黄芩与黄柏的水提物对痤疮丙酸杆菌的MIC值为0.3125mg·mL-1和0.625mg·mL-1，与本研究测得白簕水提物的MIC值1.409mg·mL-1(折算同为提取物浓度比较)要低，与白簕醇提物的MIC值0.439mg·mL-1(折算同为提取物浓度比较)相当；但朱亚芳等[8]报道黄芩和金银花的水提物MIC值为12.50mg·mL-1(生药浓度)则比本研究的水提物MIC值要高，即抑菌活性较白簕差。出现这种同种药材活性报道差异的原因可能有几个方面：第一，药材的质量差异，虽然是同种药材，如黄芩，来源不同其含有的活性成分差异也会相差很大，导致药效出现差异；第二，实验菌株的差异，同一个种的菌，其菌株不同，所表现出来的活力也会不同，朱亚芳等使用的是ATCC11827，而郑景峰使用的是BCRC10723，因此，应对具体的研究展开分析。通过这些对比可得，白簕醇提物的抑制痤疮丙酸杆菌效果较好，可能是由于其富含黄酮和多酚类物质，有利于抑制细菌的生长。

目前评价美白化妆品原料的功效，主要是以对酪氨酸酶活性的抑制效果作为主要指标。本研究以小鼠黑色素瘤B16细胞为受试细胞，测定白簕醇提物与水提物对其酪氨酸酶活性的影响，发现白簕水提物具有较好的抑制酪氨酸酶活性，而醇提物却未发现该活性，这与许多研究中植物的美白活性成分分布于醇提物中不一致[9-10]，这可能是白簕的美白活性成分与其他植物的不同，在白簕水提物中，含有多糖和蛋白等非醇溶性物质，这些都可能是白簕的美白活性成分，如银耳中的水溶性部分含有的多糖就被证实有良好的美白活性。另外，也有部分常见的美白中药，其水提物也有报道具有较好美白活性，白蔹、白芷和白及水提物抑制酪氨酸酶活性明显高于醇提物，且水提物的半数抑制浓度分别为0.35、3.80、3.89mg·mL-1 [11]，与白簕水提物相比，当抑制率为57.82%时，白簕水提物对应的用药浓度仅为800μg·mL-1，远低于被广泛研究的美白中药白芷，表明白簕水提物比白芷的抑制酪氨酸酶活性更强[12-13]，具有良好的美白活性。由于目前对白簕的美白活性研究鲜有报道，因此，后续还需要对白簕水提物的美白活性进行深入研究，如对黑色素合成的影响等，了解其美白作用机理，进一步筛选出美白活性成分，为高效利用这一药用资源提供实验依据。

综上所述，白簕有良好的抑制痤疮丙酸杆菌及抑制酪氨酸酶活性，其提取物可开发为祛痤疮产品和美白产品的原料。

[1] 陈小菊.簕菜疗法在新生儿湿疹治疗中的应用和护理成效[J].实用医学杂志，2006，22(13)：1587-1588.

[2] 肖杭，黎云祥，蔡凌云，等.白簕叶总黄酮的提取和纯化及其抑菌试验初探[J].光谱实验室，2010，27(6)：2130-2134.

[3]AbdulHamidR，TeohHK，OthmanF.Anti-inflammatoryandanti-hyperalgesicactivitiesofAcanthopanaxtrifoliatus(L) Merr leaves[J].Pharmacogn Res，2013，5(2)：129-133..

[4] 郑爽.松茸液体发酵产物的美白作用的研究[D].长春：吉林农业大学，2014：31.

[5] 王鹏.植物美白提取物的筛选及作用机理探索[D].天津：天津商业大学，2010：20.

[6] Huang C，Lee C，Chen L，et al.Antimicrobial herbs againstStaphylococcucaureusaandPropionibacteriumacnes[J].Planta Med，2010，76：P500.

[7] 郑景峰.六十种中药材热水萃出物对痤疮病原菌之抑菌性[D].台湾：台湾大同大学，2005：73-74.

[8] 朱亚芳，赵浩如.中药体外抑制痤疮丙酸杆菌的活性测定[J].药学与临床研究，2009，17(3)：224-226.

[9] 郭媛媛，赵骏.植物药及其组方美白作用的研究[J].江西中医学院学报，2008，20(4)：65-66.

[10] 刘畅，莫思颖，张怡，等.20种植物醇提物美白作用的体外测试[J].日用化学工业，2013，43(6)：450-452.

[11] 唐海谊，何冠邦，周喜林.美白中药之水及乙醇提取物对酪氨酸酶抑制功效之比较[J].中国药学杂志，2005，40(5)：342-343.

[12] 欧喜燕，于秀华.白芷美白液体外抑制酪氨酸酶活性的实验研究[J].长春中医药大学学报，2012，28(6)：960-961.

[13] 高彤彤，许云，晏志勇.不同浓度白芷美白液对人体酪氨酸酶活性抑制情况分析[J].中药材，2015，38(2)：376-378.

StudyonAntimicrobialActivityAgainstPropionibacteriumAcnesandWhiteningEffectofExtractofEleutherococcusTrifoliatusinVitro

LAOJinghui1，2，PANChaomei1*，YUQin2，NIQinggui2，SunZhongwei2，YuXiaoyi2

[1.GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006，China;2.Perfect(China)Co.，Ltd.，Zhongshan528402，China]

Objective：Antimicrobial activity againstPropionibacteriumacnesand whitening effect of extract ofEleutherococcustrifoliatuswere studied to assay the bioactivities.Methods：Antimicrobial activity againstP.acneswas evaluated by MIC.Whitening effect was tested by the tyrosinase inhibitory activity in B16cell.Results：The MIC of ethanol extract and water extract were2.5mg·mL-1，5mg·mL-1，respectively.Water extract had good tyrosinase inhibitory activity，while ethanol extract showed no effect.Conclusion：Ethanol extract had stronger activity than water extract in antimicrobial againstP.acnes，but water extract had good tryosinase inhibitory activity.

Eleutherococcustrifoliatus；extract；antimicrobial activity；whitening effect

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.008

2015-09-23)

*

潘超美，教授，研究方向：药用植物资源的开发利用；E-mail：pancm@gzucm.edu.cn