金蝉花多糖的含量组成分析及其对LPS诱导的THP-1 细胞 NF-κB 活性的研究△

杨全伟，肖柳，黄雄超，张耕，余南才，谭静玲

[1.武汉市第一医院，湖北 武汉 430000；2.武汉市中医医院，湖北 武汉 430000；3.赛珂睿德生物医药科技(上海)有限公司，湖北 武汉 430000；4.湖北省食品药品监督检验研究院，湖北 武汉 430000]

金蝉花多糖的含量组成分析及其对LPS诱导的THP-1细胞 NF-κB 活性的研究△

杨全伟1，肖柳2，黄雄超3，张耕1，余南才1，谭静玲4*

[1.武汉市第一医院，湖北 武汉430000；2.武汉市中医医院，湖北 武汉430000；3.赛珂睿德生物医药科技(上海)有限公司，湖北 武汉430000；4.湖北省食品药品监督检验研究院，湖北 武汉430000]

目的：阐明金蝉花多糖的糖含量及单糖组成，研究其对脂多糖 (Lipopolysaccharide，以下简称LPS)诱导的THP-1细胞NF-κB的活性。方法：以金蝉花为原料药材，经脱脂干燥、水提、浓缩、透析、乙醇沉淀和真空干燥后，得到金蝉花水提粗多糖。然后经二乙氨乙基纤维素(DEAE-纤维素)阴离子交换柱纯化获得4种纯化多糖。应用紫外分光光度计、高效凝胶渗透色谱(HPGPC)和气相色谱(GC)方法对其中性糖含量、糖醛酸含量，相对分子质量和单糖组成进行测量分析，同时对4种纯化金蝉花多糖进行了体外细胞免疫活性测定。结果：金蝉花粗多糖的中性糖含量为48.36%，糖醛酸含量为12.39%，总多糖含量为60.75%，相对分子质量为9.3×103Da，单糖组成物质的量比分别为阿拉伯糖(Ara)∶木糖(Xyl)∶甘露糖(Man)∶半乳糖(Gal)∶葡萄糖(Glc)=0.42∶0.29∶4.14∶6.38∶6.8。4种金蝉花纯化多糖中，只有0.2mol·L-1氯化钠(NaCl)溶液洗脱的金蝉花纯化多糖(CSTA2)在高浓度(1000μg·mL-1)时具有较强的免疫抑制作用，其对NF-κB的活化率仅为77.2%，不仅远低于阳性对照LPS组，而且比空白对照还要低。高浓度(1000μg·mL-1)和低浓度(100μg·mL-1)的蒸馏水洗脱金蝉花纯化多糖(CSTA0)均具有较强的免疫抑制作用，且显示良好的浓度依赖性，浓度越低抑制作用越强。结论：金蝉花粗多糖主要由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和少量的阿拉伯糖(Ara)和木糖(Xyl)组成。金蝉花纯化多糖对LPS诱导 THP-1细胞产生的 NF-κB的抑制作用随着质量浓度的升高和(或)洗脱剂种类和浓度的不同会发生明显变化，高浓度(1000μg·mL-1)的0.2mol·L-1NaCl溶液洗脱金蝉花纯化多糖(CSTA2)和低浓度(100μg·mL-1)的蒸馏水洗脱金蝉花纯化多糖(CSTA0)具有较强的免疫抑制作用，具有较高的肿瘤抑制活性，具有深入研究的价值。

金蝉花；多糖；分离纯化；单糖组成；NF-κB

金蝉花别名蝉花、虫花，为麦角菌科真菌棒束孢菌IsariacicadaeMiquel的孢梗束或大蝉草CordycepscicadaeShing的干燥子座及所寄生虫体的干燥复合体[1]。它是一种与“冬虫夏草”相似的菌体珍贵中药材，其味甘性寒，无毒，具有疏风散热、透疹止痒、息风止痉、明目退翳的功效。宋代唐慎微所著的《经史证类备急本草》中就有其治疗小儿夜啼惊风的记录。药理实验表明，金蝉花具有眼部消炎、镇静镇痛、改善肾功能、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等方面的作用，特别是金蝉花多糖提取物具有显著的免疫调节和抗肿瘤作用[2-5]。

金蝉花含有丰富的蛋白质、多种氨基酸和微量元素营养成分[6]，还含有多糖、虫草酸、生物碱腺苷和多球壳菌素等活性成分[7]。目前，国内外关于金蝉花的研究较少，研究主要集中在金蝉花粗提取活性和金蝉花多糖提取和含量检测方面。对金蝉花多糖的分离纯化及纯化后金蝉花多糖的单糖组成和药理活性尚未见报道。本研究以浙江金蝉花为原料，对其中金蝉花多糖进行单糖组成研究和分离纯化，并对纯化后的金蝉花多糖对LPS 诱导的 THP-1 细胞 NF-κB 活性进行研究，为深入开展金蝉花多糖研究，奠定了一定的有效物质研究基础。

1 材料与仪器

1.1材料

金蝉花(北京同仁堂浙江中药材有限公司，产地为浙江丽水)，经孙海林主任药师鉴定为金蝉花正品。

半乳糖醛酸标准品和葡萄糖标准品 (中国食品药品检定研究院)，单糖标准品：L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖和D-葡萄糖(美国 Fluka 公司，纯度均为99.0%)，已知相对分子质量的标准品：葡聚糖Dextran T-(末端-)2000、T-700、T-580、T-500、T-80、T-70、T-40、T-11、T-9.3和 T-4(瑞典 Pharmacia 公司)，二乙氨乙基纤维素(DEAE-Cellulose)(英国Whatman 公司)，碘甲烷(上海中国远航试剂厂)，牛血清白蛋白(BSA电泳级，北京红星生物化学制品厂)，硼氢化钠(NaBH4)、三氟乙酸(TFA)和二甲基亚砜(DMSO)(德国 Merck 公司)，电透析袋(分子截留为相对分子质量3500，上海绿鸟公司)，RPMI-1640培养基(美国Thermo 公司)，胎牛血清(美国Gibco 公司)，G418培养基(德国Merck 公司)，Lipofectamine2000转染试剂(美国 Invitrogen 公司)，脂多糖(LPS)(美国Sigma公司)。95%乙醇、无水乙醇、丙酮、浓硫酸、苯酚、三氯甲烷、正丁醇、氢氧化钠、四硼酸钠、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、硝酸钠(NaNO3)、叠氮化钠(NaN3)、间羟基联苯、乙酸乙酯、吡啶、乙酸、苯胺、邻苯二酸、甲醇、甲苯、乙酸酐、无水硫酸钠等试剂购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2仪器

B5-1磁力搅拌器、BSZ-100自动部分收集器和HL-2恒流泵(上海青浦沪西仪器厂)，Beckman高速离心机(美国Beckman公司)；752N紫外可见分光光度计(上海精科仪器有限公司)，II级生物安全柜(上海立康生物医疗科技公司)，SerialII细胞培养箱(美国Thermo公司)，荧光素酶检测仪(美国Promega公司)，Novostar全波长双板多功能仪/酶标仪(美国BMGLabtech公司)，GC-14BPF型气相色谱仪(日本岛津)，Agilent1260Series高效液相系统，96孔微量培养板(美国Corning公司)，微孔滤膜、抽滤瓶等均购自国药集团化学试剂有限公司。

细胞系：THP-1/pGF1-NF-κB；稳转NF-κB，转染方法：人THP-1细胞系以RPMI-1640培养基培养，培养基中含10%胎牛血清，培养条件为37℃，含5%CO2。将NF-κB荧光素报告质粒pGF1-NF-κB与空白质粒pCDNA3.1用Lipofectamine2000进行共转。融合后，将细胞换到含0.8mg·mL-1G418(德国Merck公司)完全培养基中继续培养。3周后分离形成的单克隆，用1μg·mL-1LPS作为刺激物在荧光素酶检测系统中进行检测。

2 方法

2.1金蝉花多糖的制备

取金蝉花药材1kg，加入10倍体积95%乙醇水溶液脱脂，干燥后用10倍体积沸水提取，每次2h，提取3次，合并提取液，加热浓缩至合适体积后，离心，上清液用流动水透析2d，以除去色素和小分子无机物等。然后将透析袋内液浓缩至约1.5L，离心后取上清液用4倍体积95%乙醇于4℃下进行沉淀，静置过夜，离心。沉淀物用无水乙醇和丙酮依次洗涤3次后，于60℃真空干燥器中干燥，得到金蝉花水提粗多糖。

2.2DEAE-纤维素阴离子柱色谱纯化

取金蝉花粗多糖溶于蒸馏水中，制成浓度为20mg·mL-1的溶液，利用DEAE-纤维素阴离子交换柱(50cm×5cm)色谱进行分离，上样前以8000r·min-1高速离心20min除去不溶物。先用去离子水进行洗脱，再依次用0.1、0.2、0.3mol·L-1的NaCl梯度洗脱，硫酸-苯酚法280nm处以紫外分光光度计进行跟踪检测，合并洗脱的单一高峰部分，浓缩至小体积后对去离子水透析，冷冻干燥后得到纯化多糖。

2.3中性糖含量、糖醛酸含量测定和相对分子质量测定 为了确定金蝉花粗多糖的纯度，即总多糖含量及相对分子质量分布，进一步进行了中性糖含量、糖醛酸含量的测定和相对分子质量范围的测定。

精确称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖50mg，置于50mL的量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，取5mL于50mL量瓶中定容，即为0.1mg·mL-1葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于试管中，加水至2.0mL，再加5%的苯酚溶液1.0mL，摇匀，加浓硫酸5.0mL，摇匀，静置10min，100 ℃沸水水浴中加热30min，冷却至室温，以0mL管为参比，490nm处测定各管多糖溶液的吸光度。以吸光值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，制作标准曲线。称取25mg金蝉花水提粗多糖(CSTA)产品加水30mL使溶解，离心除去沉淀，定容于50mL容量瓶中，配制成0.5mg·L-1的溶液，取0.2mL加水至2mL，加入1mL5%的苯酚溶液，摇匀，再迅速加入5mL浓硫酸，摇匀，静置10min，100 ℃沸水水浴中加热30min，冷却至室温，490nm处测定吸光度，根据标准曲线，计算样品中中性糖的含量[8]。

分别取标准半乳糖醛酸溶液(50μg·mL-1) 0、50、100、200、250μL于带塞试管中，用蒸馏水加至250μL。在冰浴中预冷，然后加入l.5mL0.012 5mol·L-1四硼酸钠硫酸溶液。振摇混合均匀，沸水浴加热5min。再用冰浴冷却至室温，加入25μL含0.5%氢氧化钠(NaOH)的0.15%间羟基联苯，混合均匀，放置20min后，用紫外可见分光光度计于520nm处测定吸光度，绘制标准曲线。另取5.8mgCSTA加入50mL蒸馏水，按照上述方法测定，根据标准曲线，计算样品中糖醛酸的含量。金蝉花粗多糖的纯度以总多糖含量表示，总多糖含量=中性糖含量+糖醛酸含量[9]。

取浓度为0.1mol·L-1的磷酸二氢钠(NaH2PO4)和0.3mol·L-1的硝酸钠(NaNO3)配制缓冲液，然后用1mol·L-1的NaOH溶液调pH为7.0，再加10mL的10mg·mL-1的叠氮化钠(NaN3)，所配制的溶液用0.45μm的滤膜过滤，超声真空脱气30min。取已知相对分子质量的 葡聚糖DextranT-系列标准葡聚糖T-2000、T-700、T-580、T-500、T-110、T-80、T-70、T-40、T-11、T-9.3和T-4各2mg，溶于1mL流动相缓冲液中，10 000r·min-1离心15min，取上清液，每次进样20μL，以相对分子质量的对数值对保留时间作标准曲线。样品按上述方法操作，然后根据标准曲线计算出该多糖的相对分子质量[10-11]。

2.4单糖组成研究

为了初步确定金蝉花粗多糖的结构组成，进行了单糖组成研究。

取金蝉花粗多糖样品2mg，加入3mL2mg·L-1三氟乙酸(TFA)，在110 ℃下水解3h，40 ℃下减压浓缩蒸干，再加3mL甲醇反复减压浓缩至干燥，重复4次，以除去残留的TFA。将残余物用0.5mL蒸馏水溶解，吸取5μL在纤维素板上点样，与标准单糖对照进行薄层色谱分析，展开剂为乙酸乙酯-吡啶-水-乙酸(5∶5∶3∶1)，显色剂为苯胺-邻苯二酸，薄层色谱板于110 ℃加热10min显色。在剩余溶液中加25mgNaBH4，室温下还原3h，然后用 25%乙酸中和，再调pH值为4～5。减压浓缩，加甲醇数次蒸干以除去反应副产物硼酸及水后，加入2mL乙酸酐，100 ℃反应1h，反应液加甲苯，重复多次，减压浓缩至形成干燥粉末。再用三氯甲烷萃取乙酰化产物，加入等体积蒸馏水洗涤3次后，加入无水硫酸钠除去三氯甲烷层中残留水分，减压浓缩后进行GC分析[12-13]。

2.5对LPS诱导的THP-1细胞NF-κB抑制作用的体外细胞免疫活性实验分析 将处于对数生长期的 THP-1/pGF1-NF-κB细胞按每孔50 μL接种于96孔微量培养板内，细胞浓度为1×106个·mL-1，培养24 h后每孔加入以培养基稀释的多糖样品50 μL，使得终质量浓度分别为 100、1 000 μg·mL-1，每个质量浓度均为2个复孔，另设空白对照孔(Blank组，仅加相应体积的样品溶解液)和阳性对照孔(每孔加入20 μL 10 μg·mL-1LPS，终质量浓度为1 μg·mL-1)。细胞在37 ℃、5% CO2条件下培养15 min后，加入20 μL 10μg·mL-1LPS，使其终质量浓度为1 μg·mL-1。细胞培养 6 h后，去除孔中的培养基，以虫荧光素酶检测系统中的裂解液1×E2661裂解细胞，每孔100μL，裂解后转入96孔荧光检测板，每孔加入40 μL检测底物，立即读取相对光单位(Relative Light Unit，RLU)，并按公式计算样品对NF-κB的活化率。

活化率 =RLU样品/RLU空白×100%

3 结果

3.1金蝉花多糖的分离纯化

干燥的金蝉花药材，经脱脂干燥、水提、浓缩、透析、乙醇沉淀和真空干燥后，得到CSTA，得率为11.17%。CSTA经DEAE-纤维素阴离子交换柱(称取约5g样品溶于50mL蒸馏水，离心，上样)分离纯化后，根据不同洗脱溶剂所得纯化多糖分别命名为CSTA0(蒸馏水洗脱，得率7.74%)、CSTA1(0.1mg·L-1NaCl溶液洗脱，得率0.31%)和CSTA2(0.2mg·L-1NaCl溶液洗脱，得率0.86%)，CSTA3(0.3mg·L-1NaCl溶液洗脱，得率0.86%)。

3.2金蝉花多糖的中性糖含量、糖醛酸含量和相对分子质量分析 作得中性糖标准曲线回归方程为Y=13.034X+0.1928(r=0.9962)，其中Y为吸光度，X为质量浓度(mg·mL-1)，根据CSTA吸光度为0.828计算得CSTA糖醛酸含量为48.36%。

作得糖醛酸标准曲线回归方程为Y=0.024X-0.081(r=0.992)，其中Y为吸光度，X为浓度(mg·mL-1)，根据CSTA吸光度为0.057计算得CSTA糖醛酸含量为12.39%。

CSTA的高效凝胶渗透色谱(HPGPC)结果见图1，根据所作标准曲线得回归方程Y=-0.1666X+10.914(r=0.9974)，其中Y为相对分子质量取以10为底的对数值，X为保留时间。由于HPLC检测使用的是示差检测器，45.736min及后面的倒峰为缓冲溶剂的峰。根据CSTA的保留时间41.815min计算得CSTA的重均相对分子质量9.3×103Da。 CSTA的纯度即总多糖含量为60.75%。

图1 金蝉花水提粗多糖(CSTA)HPGPC图

3.3金蝉花多糖的糖组成结果分析

单糖标准品气相色谱图见图2，金蝉花粗多糖的单糖组成见表1。根据实验结果计算可知，金蝉花粗多糖主要由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)以及少量的阿拉伯糖(Ara)和木糖(Xyl)组成，鼠李糖含量极少，考虑误差因素，可以忽略不计。单糖组成物质的量比为Ara-Xyl-Man-Gal-Glc(0.42∶0.29∶4.14∶6.38∶6.8)。

图2 单糖标准品气相色谱图

单糖组分名保留时间/min峰面积/uV·s面积比(%)含量(%)物质的量比鼠李糖(Rha)4.79518220.014380.014380.02阿拉伯糖(Ara)6.107442090.348860.348860.42木糖(Xyl)7.905307970.243030.243030.29甘露糖(Man)15.4175244904.138884.138884.14半乳糖(Gal)17.1058082486.378086.378086.38葡萄糖(Glc)18.6988614436.797856.797856.80

3.4金蝉花多糖对LPS诱导的THP-1细胞NF-κB抑制作用的体外细胞免疫实验的分析 为了探索金蝉花纯化多糖可能存在的免疫调节活性，利用THP-1/pGF1-NF-κB细胞系检测不同浓度NaCl洗脱的金蝉花纯化多糖对核转录因子NF-κB的抑制作用，以样品对NF-κB的活化率作为评价指标，结果见图3。

图3 金蝉花纯化多糖对核因子 NF-κB 的抑制作用

由于脂多糖LPS 诱导的转染的THP-1/pGF1-NF-κB细胞产生核因子NF-κB，进而产生一系列的反应使机体产生炎症反应与细胞变异增殖等[14]。因此调控NF-κB活化的过程，可以控制免疫反应的敏感性，NF-κB的活化率越小，免疫抑制作用越强，从而抑制肿瘤的发生。

从图中可以看出，低浓度(100 μg·mL-1)时，活化率大小顺序为：Blank

与LPS组比较，蒸馏水洗脱CSTA0在高浓度和低浓度时活化率均下降，且低浓度时下降更多，显示其可以产生抑制NF-κB活化的作用。0.2 mol·L-1NaCl溶液洗脱的CSTA2在高浓度时下降更多，但低浓度却略有升高，显示高浓度的CSTA2可以产生抑制NF-κB活化的作用，但低浓度的CSTA2会产生激活NF-κB活化的作用。CSTA1和CSTA3的活化率与LPS的活化率相差不大，显示其可能没有抑制NF-κB活化的作用。

NF-κB 转录活性实验结果表明，金蝉花纯化多糖对LPS诱导的THP-1细胞NF-κB的抑制作用随着质量浓度的升高和(或)洗脱剂种类和浓度的不同会发生明显变化。其中高浓度(1000 μg·mL-1)的0.2 mol·L-1NaCl溶液洗脱CSTA2和低浓度(100 μg·mL-1)的蒸馏水洗脱CSTA0对NF-κB的活化率较小，具有较强的免疫抑制作用，具有较高的肿瘤抑制深入研究价值。

4 讨论

本实验选取金蝉花为原料药材，通过水提醇沉获得粗多糖，然后经过DEAE柱色谱进行分离纯化，获得4种初步纯化的多糖。对金蝉花粗多糖的中性糖含量、糖醛酸含量和单糖组成进行了初步分析，结果表明金蝉花粗多糖的中性糖含量为48.36%，糖醛酸含量为12.39%，总多糖含量为60.75%，相对分子质量为9.3×103Da。经分析知金蝉花粗多糖主要由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和少量的阿拉伯糖(Ara)和木糖(Xyl)组成。但由于多糖结构的复杂性，尚未对此多糖进一步纯化和对精细结构进行进一步讨论，接下来本实验课题组拟通过部分酸水解、完全酸水解、酶解、红外和核磁共振等分析方法进行深入研究。

同时通过体外细胞免疫的NF-κB转录活性实验，对金蝉花多糖抑制LPS诱导的THP-1细胞NF-κB的生物活性进行了测定，拟寻找较好的治疗癌症的先导药物，并探索其可能存在的免疫调节活性。结果表明金蝉花纯化多糖对LPS诱导的THP-1细胞NF-κB的抑制作用随着质量浓度的升高和(或)洗脱剂种类和浓度的不同会发生明显变化。其中高浓度(1000μg·mL-1)的0.2mol·L-1NaCl溶液洗脱CSTA2和低浓度(100μg·mL-1)的蒸馏水洗脱CSTA0具有较强的免疫抑制作用，具有较高的肿瘤抑制活性，具有深入研究的价值。

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PolysaccharideContentandCompositionAnalysisofGoldenCicadaFlowersandEffectonNF-κBActivityofLPSInductedTHP-1Cells

YANGQuanwei1，XIAOLiu2，HUANGXiongchao3，ZHANGGeng1，YUNancai1，TANJingling4*

[1.WuhanNo.1Hospital，Wuhan430000，China；2.WuhanhospitaloftraditionalChinesemedicine，Wuhan430000，China；3.SacCharidiaBio-PharmaceuticalTechnology(ShangHai)Co.LTD，Wuhan430000，China；4.Hubeiinstituteforfoodanddrugcontrol，Wuhan430000，China]

Objective：To clarify golden cicada flower polysaccharide content and monosaccharide composition of polysaccharides，and study the nf-kappa B activity of THP1cells induced by LPS.Methods：Polysaccharide from golden cicada flower was obtained by water extraction，dialysis purification，ethanol precipitation and vacuum drying，and further purified by DEAE cellulose-anion exchange column.4kinds of purified polysaccharides were obtained.HPGPC and GC were applied to determine uronic acid content，the relative molecular mass and the monosaccharide composition.4kinds of polysaccharides were tested for LPS induced the nf-kappa B signals of THP1cells.Results：The neutral polysaccharide content of crude Golden cicada flower was48.36%，the polysaccharide uronic acid content was12.39%.The total polysaccharide content of crude Golden cicada flower was60.75%.The relative molecular mass was9.3×103Da，molar ratio of monosaccharide composition was Xyl-Man-Gal-Glc (0.42∶0.29∶4.14∶6.38∶6.8).Polysaccharide purified by0.2mol.L-1NaCl solution elution (CSTA2) at high concentration (1000μg·mL-1) showed the strong immune inhibitory effect，the activation rate reached only77.2%，which was not only far lower than the positive control LPS group，and even lower than ck.High concentration (1000μg·mL-1) and distilled water of low concentration (100μg·mL-1)elution golden cicada flower purified polysaccharide (CSTA0) showed lower activation rate，and a good concentration dependence.Conclusion：Golden cicada polysaccharide is mainly composed of glucose (Glc)，galactose (Gal)，mannose (Man) and a small amount of arabinose (Ara) and xylose (Xyl).The purified polysaccharides shows THP1cells induced by LPS nf-kappa B inhibition.The purified polysaccharide CSTA2and CSTA0shows stronger immune inhibition，and deserve for further study.

Golden cicada flowers，polysaccharide，separation and purification，monosaccharide composition，NF-κB

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.010

2015-12-28)

武汉市科技攻关项目 (2013060602010263)

*

谭静玲，副主任药师，研究方向：中药分析；E-mail：290415991@qq.com