基于一测多评法评价天麻活性成分的质量控制方法

唐爽，包永睿，2，3，孟宪生，2，3 *，富力，王帅，2，3

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连 116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 116600；4.大连富生天然药物开发有限公司，辽宁 大连 116600)

基于一测多评法评价天麻活性成分的质量控制方法

唐爽1，包永睿1，2，3，孟宪生1，2，3 *，富力4 *，王帅1，2，3

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连116600；4.大连富生天然药物开发有限公司，辽宁 大连116600)

目的：采用一测多评技术建立不同产地天麻活性成分的质量控制方法，为更加全面提升天麻质量控制方法提供依据。方法：采用高效液相色谱法，以天麻素为内标物，建立其与腺苷、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷A的相对校正因子，对10种不同产地天麻的总苷进行含量测定。结果：采用相对校正因子法对10种不同产地天麻活性成分含量值进行计算，将计算值与外标法的实测值进行比较，二者无统计学差异。结论：采用一测多评法测定10种不同产地天麻中活性成分的含量，该方法为天麻药材的品质优劣鉴定提供依据，为全面提升天麻药材的质量提供新方法。

天麻；天麻活性成分；一测多评；质量控制

天麻为兰科天麻属植物天麻GastrodiaelataB1.的干燥块茎，味甘，性平，归肝经，其功效为熄风止痉。主产于我国云南、贵州、四川、陕西等地，有野生和种植之分，被列为常用名贵中药。中药材市场上天麻鱼目混珠，有关天麻药材质量控制方法的研究已有一些报道，《中华人民共和国药典》及部分文献对天麻的质量控制方法较为简单，仅测定了天麻素的含量，在对中药进行质量评价时，选择单一成分存在很多不足，并且大部分文献多以天麻整体药材为研究对象，某些含量不高的有效成分无法测定，不能够全面反应中药材质量。天麻在药理上有镇痛、镇静、增加血流量、减少血管阻力、改善供血等作用，还具有抗氧化及细胞保护、益智健脑、延缓衰老的作用。其中腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷A 均具有抗血小板聚集作用，故对天麻的活性成分进行提取、富集，得到纯度较高的天麻活性成分，同时采用一测多评技术[1]同时测定天麻活性成分中腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷A 5种成分的含量，该方法简便、可行，为天麻药材的质量控制规范及标准制定奠定实验基础。本文收集10种不同产地天麻药材，包括道地及野生，对10种不同产地天麻活性成分的含量进行测定，方法可行，为天麻药材的品质优劣鉴定提供依据，为中药有效组分的质量控制提供新方法[2-3]。

1 仪器与材料

1.1主要仪器

Agilent-1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；CP225D电子分析天平(德国Sartorius分析天平有限公司，十万分之一)；MiLLi-Q超纯水处理装置(美国Millipore公司)；CO2培养箱(德国NUAIRE公司)；AE31型倒置相差显微镜(Motic公司)；SUNRISE酶标仪(瑞士TECAN公司)。

1.2主要试药

天麻药材购自安国药材批发市场，产地分别为安徽、辽宁丹东、贵州、河北、辽宁凤城、湖北、吉林、辽宁本溪、四川、云南丽江(野生)。天麻素对照品(批号：110807-201306)、腺苷对照品(批号：110807-201308)均购于中国食品药品检定研究院；对羟基苯甲醇对照品(批号：130712)、对羟基苯甲醛对照品(批号：140301)、巴利森苷A对照品(批号：140320)均购于四川省维克奇生物科技有限公司；乙腈(色谱级，美国Fisher公司)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1混合对照品溶液的制备

分别称取腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷A对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1mL含腺苷0.116mg、天麻素1.080mg、对羟基苯甲醇0.100mg、对羟基苯甲醛0.010mg、巴利森苷A3.266mg的对照品溶液，摇匀，即得[4-5]。

2.2供试品溶液的制备

取天麻药材约5g，粉碎(过40目筛)，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入50mL70%乙醇，回流提取3次，每次1h，过滤，滤液浓缩至10mL，上AB-8树脂柱(10g)，用10mL蒸馏水除杂，再用50mL90%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移定容至10mL量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液即得[6]。

2.3色谱条件

AglientTC-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.04%甲酸水溶液，梯度洗脱(0→3→10→12→30→60min，2%→2%→8%→9%→9%→30%乙腈)；检测波长：270nm；流速：1.0mL·min-1；柱温：30℃；进样量：5μL[7-8]。色谱图见图1、2。

注：1.腺苷；2.天麻素；4.对羟基苯甲醇；8.对羟基苯甲醛；11.巴利森苷A；下同。图1 天麻供试品HPLC色谱图

图2 对照品HPLC色谱图

2.4方法学考察

2.4.1线性范围考察 精密吸取上述混和对照品溶液1、3、5、10、14、18μL，注入高效液相色谱仪中，按照上述色谱条件分析，测定各自峰面积，以对照品进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得各对照品的线性回归方程，结果见表1。表明各化合物在相应范围内线性关系良好。

表1 各被测成分的线性回归分析结果

2.4.2 精密度试验 吸取混合对照品溶液5 μL，按上述色谱条件分析，连续进样6次，记录各色谱峰的峰面积，结果测得腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷A峰面积值的RSD分别为0.79、1.03、1.83、2.50、1.08%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18、24 h进样，测定各指标性成分峰面积，结果测得腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷A峰面积值的RSD分别为0.94%、1.10%、2.87%、2.02%、1.98%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 取同一样品6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别测定各指标性成分峰面积，按外标法计算样品含量，结果测得腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷A含量分别为0.177、4.330、0.112、0.026、9.754 mg·g-1，其RSD分别为1.47%、1.32%、1.26%、2.88%、0.97%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取天麻样品2.5 g，共6份，分别精密加入腺苷0.225 mg·mL-1、天麻素5.25 mg·mL-1、对羟基苯甲醇0.076 mg·mL-1、对羟基苯甲醛0.027 mg·mL-1、巴利森苷A12.005 mg·mL-1混合对照品2 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，并按上述方法测定样品含量，计算加样回收率。结果腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷A的平均加样回收率分别为99.07%、98.10%、98.81%、100.00%、98.51%，RSD分别为0.82%、1.21%、1.07%、2.34%、0.95%，结果表明该方法法具有良好的回收率。

2.5相对校正因子的计算

在标准曲线Y=aX+b中，由于b值通常为误差引起，在a/b值大于100时，b/a值可以忽略不计，此时可以X=Y/a直接计算，故相对校正因子(fk/s)可以用二者的斜率a之比来直接计算，相对校正因子计算公式为：fk/s=(ak/as)，即可以参照物快速推算其余待测化学成分的含量，计算公式为：Ck=Ak/(as×fk/s)。式中 as为参照物斜率，ak为待测组分对照品斜率，Ck为待测组分浓度，Ak为待测组分峰面积[9-10]。结果腺苷、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷A的fk/s分别为9.208、2.634、44.654、0.476。见表2。

表2 天麻中4种成分的相对校正因子的计算

2.6相对校正因子重现性考察

本试验考察2套色谱系统(Agilent1100和Waters2695)以及不同色谱柱(AglientTC-C18和PhenomenexLunaC18)对相对校正因子的影响，表2结果显示各成分的相对校正因子RSD≤2.17%。表明各成分的相对校正因子重复性良好。

2.7一测多评法与常规法测定结果的比较

分别取10批不同产地的天麻药材粉末各5g，精密称定，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件进样测定，再分别用外标法和一测多评法计算10批不同产地天麻中5种成分的含量，见表3。结果经t检验及person相关分析证明2种方法结果无统计学差异，可见一测多评在天麻的多指标成分质量评价中应用是可行的。由数据可知天麻活性成分中天麻素含量为0.594～4.364 mg·g-1、腺苷含量为0.178～0.397 mg·g-1、对羟基苯甲醇含量为0.038～0.648 mg·g-1、对羟基苯甲醛含量为0.006～0.034 mg·g-1、巴利森苷A含量为7.024～14.345 mg·g-1。以上5种成分均与血小板作用密切相关，因此可通过进一步的药效实验来制定天麻活性成分中该5种成分的定量标准。

表3 天麻中4种成分含量测定结果 /mg·g-1

3 讨论

中药的质量控制研究是中药研究的重要部分，在天麻的质量控制研究中，在以往文献中多以天麻整体药材为研究对象，某些含量不高的有效成分无法测定，相关研究表明其主要的化学活性成分为天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛等成分，故本文以组分中药为出发点，在前期的组分富集基础上，对纯度较高的天麻活性成分进行质量控制，该方法为现代化进程中新药研发和中药质量标准提供研究思路及研究路线。

天麻属名贵中药材，分布遍及全国各地，分为野生和栽培，道地主产区有贵州、四川，同时安徽产地在市场流通中占据很大一部分，但其伪品也有很多，优劣难辨，严重影响天麻药材的质量，故本文收集10种不同产地的天麻(包括道地、市场流通较多及野生品种)，建立其质量控制方法，该方法可行，为天麻药材的品质优劣鉴定提供依据，有效评价天麻药材的安全性和有效性，从而建立更加全面的质量标准。

本文采用QAMS技术实现对天麻中5种有效化学成分同时段进行多指标含量测定，一测多评技术的研究思路侧重从量上阐明主要成分或药效成分间的相互关系，多用于同类型或同系列化合物，因为该类化合物测定波长基本一致，即使换不同仪器其重现性也较好。一测多评技术更是解决中药对照品难以分离或性质不稳定、易分解等一系列问题。相对校正因子的运用能够实现在对照品短缺或特别昂贵情况下的多指标成分含量测定。天麻中对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷A对照品价格较贵，而采用本文方法，仅以价格便宜的天麻素对照品即可实现天麻中多指标成分定量，即以一个内参对照品控制多个与药效相关的化学成分，其测定方法具有一定应用价值。

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StudyonQAMSMethodforQualityControlofTotalGlycosidesinGastrodiaElata

TANGShuang1，BAOYongrui1，2，3，MENGXiansheng1，2，3*，FULi4*，WANGShuai1，2，3

(1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China；2.Liaoningprovincemulti-componentChineseMedicineEngineeringTechnologyResearchCenter，Dalian116600，China；3.LiaoningProvinceModernTraditionalChineseMedicineResearchandEngineeringLaboratory，Dalian116600，China；4.DalianFushengNaturalDrugDevelopmentCo，Ltd，Dalian116600，China)

Objective：To establish a quality control method of the active ingredients inGastrodiaelatafrom10batches by quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS) technology and provide the basis for more comprehensively improving the quality control method ofG.elata.Methods：The HPLC was adopted for establishing the relative correction factors between gastrodin used as internal standard and adenosine，p-hydroxybenzyl alcohol，p-hydroxybenzaldehyde and parishin A，and then determined the contents of multiple components.Results：Using relative correction factor method for10different origins ofG.elataactive ingredients content value calculation，the calculated value compared with measured values，there was no significant difference.Conclusion：The QAMS is feasible and accurate to evaluate the contents of the active ingredients ofG.elatafrom10batches，the method provide the basis for quality identification ofG.elataand a new way to improve Chinese traditional medicine quality control standards.

Gastrodiaelata；active ingredients ofGastrodiaelata；QAMS method；quality control

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.011

2015-10-22)

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孟宪生，教授，博士生导师，研究方向：中药药效物质和作用机制，Tel：(0411)85890185，E-mail：mxsvvv@126.com；富力，博士，教授级高级工程师，研究方向：天然产物化学，Tel：(0411)39962699，E-mail：2729677386@ qq.com