蓝刺头多糖体外抗氧化及抗菌活性的研究

杨　斌,萨茹丽,张月梅,达来宝力格,宋　越,宋爱军,陈　伟,卢　岩,刘　敏,杨　英,赵世华

(1.内蒙古农牧业科学院 兽医研究所,内蒙古 呼和浩特　010031;2.内蒙古农业大学 动物科学学院,内蒙古 呼和浩特　010018;3.内蒙古农业大学 兽医学院,内蒙古 呼和浩特　010018)



蓝刺头多糖体外抗氧化及抗菌活性的研究

杨斌1,萨茹丽2,张月梅1,达来宝力格1,宋越1,宋爱军1,陈伟1,卢岩1,刘敏1,杨英3,赵世华1

(1.内蒙古农牧业科学院 兽医研究所,内蒙古 呼和浩特010031;2.内蒙古农业大学 动物科学学院,内蒙古 呼和浩特010018;3.内蒙古农业大学 兽医学院,内蒙古 呼和浩特010018)

通过研究蓝刺头粗多糖及其洗脱纯化组分蓝刺头多糖A、B、C的体外抗氧化和抗菌作用,初步确定蓝刺头多糖的生物活性。结果显示,添加浓度相同时，蓝刺头粗多糖的总还原能力以及清除DPPH有机自由基能力最强，显著高于蓝刺头多糖A，极显著高于蓝刺头多糖B、C。当添加浓度为0.1～0.3 mg/mL时，蓝刺头粗多糖清除羟基自由基的能力略高于蓝刺头多糖A，但差异不显著；当添加浓度为0.4 mg/mL时，蓝刺头粗多糖清除羟基自由基的能力略高于蓝刺头多糖A，蓝刺头多糖A略高于蓝刺头多糖B，三者差异不显著，但均极显著高于蓝刺头多糖C，当添加浓度为0.5 mg/mL时，蓝刺头粗多糖清除羟基自由基的能力显著高于蓝刺头多糖A、B，极显著高于蓝刺头多糖C。试验条件下，蓝刺头粗多糖和蓝刺头多糖A对大肠杆菌为低度敏感，最低抑菌浓度均为0.62 mg/mL，蓝刺头多糖B和C对大肠杆菌不敏感，最小抑菌浓度均为1.25 mg/mL；蓝刺头粗多糖、蓝刺头多糖A、B和C对金黄色葡萄球菌为不敏感，最低抑菌浓度分别为1.25，2.50，2.50，2.50 mg/mL；蓝刺头粗多糖、蓝刺头多糖B、C对铜绿假单胞菌为不敏感，最低抑菌浓度均为5.00 mg/mL，蓝刺头多糖A对铜绿假单胞菌无抑制作用；蓝刺头粗多糖和蓝刺头多糖A、B、C对沙门氏菌均为不敏感，最低抑菌浓度分别为2.50，2.50，1.25，5.00 mg/mL。说明蓝刺头粗多糖的抗氧化能力最强，其次为蓝刺头多糖A，而蓝刺头多糖B和C的抗氧化能力较弱。蓝刺头粗多糖和蓝刺头多糖A具有一定的抗大肠杆菌活性，蓝刺头粗多糖和蓝刺头多糖A、B、C均无抗金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌以及沙门氏菌活性。

蓝刺头;多糖;抗氧化活性;抗菌活性

蓝刺头(EchinopslatifoliusTausch,ET)为菊科蓝刺头属植物,全球约120余种,中国约有19种,主要分布在东北、西北地区。中医将其根入药,具有清热解毒、排脓止血等功效。蒙医则将其干燥花序以及种子入药,用于接骨愈伤、清热止痛等疾病。除此之外,国外研究者将其用于治疗偏头痛、麻风病、肺结核、梅毒等疾病,均取得了良好的治疗效果[1-2]。我国对蓝刺头属植物研究较多的主要是蓝刺头、砂蓝刺头、华东蓝刺头、新疆蓝刺头等,虽然国外相关报道较多,但多集中于本国或本地区的代表品种,研究的方向主要集中于对成分的分离鉴定和生物活性研究2个方面[3-4]。本试验以蓝刺头粗多糖及不同洗脱所得精多糖为研究对象探讨不同蓝刺头多糖的总还原能力、体外清除DPPH有机自由基、清除羟基自由基能力以及体外对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌的抗菌活性,目的为确定蓝刺头多糖的活性成分,进一步研究蓝刺头多糖的生物活性提供理论依据。

1　材料和方法

1.1材料与试剂

蓝刺头粗多糖及蓝刺头精多糖:实验室自制,方法依据家畜普通病研究课题组已报道方法进行[5]。菌种:大肠杆菌(ATCC-25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC-25923)、铜绿假单胞菌(27853)和沙门氏菌(50096),所用菌种均由内蒙古医科大学病原微生物实验室提供,使用前均需将菌株复苏培养,选用对数生长期细菌进行试验。

清除羟基自由基试剂盒购自南京建成生物科技公司;DPPH、BHT、DMSO、MTT等均购自美国Sigma公司;营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、麦芽糖、蛋白胨、琼脂等购自广东环凯生物科技有限公司;PBS溶液购自Hyclone公司;铁氰化钾、三氯乙酸以及三氯化铁等其他试剂均为国产分析纯。

1.2主要仪器

Synergy H4多功能酶标仪、离心机、恒温生化培养箱、微量振荡混匀机等。

1.3试验方法

1.3.1蓝刺头多糖的提取与分离纯化称取75 ℃烘干至恒重的蓝刺头500 g,加10倍水浸泡12 h,煮沸提取2 h,过滤收集滤液,滤渣再同法煎煮1次,过滤,合并2次滤液,旋转蒸发仪浓缩至1 000 mL。边搅拌边缓慢加入无水乙醇至乙醇终浓度为80%,4 ℃沉淀24 h,3 000 r/min离心 30 min收集沉淀。沉淀挥去乙醇后用热水复溶,置于冷冻干燥机中冻干,得蓝刺头粗多糖(Crude polysaccharide ofEchinopslatifoliusTausch,ETCP)。

将所得蓝刺头粗多糖经DEAE-52离子交换柱层析后分别使用蒸馏水、0.1,0.2 mol/L氯化钠溶液进行洗脱,洗脱成分分别命名为蓝刺头多糖A (EchinopslatifoliusTausch polysaccharide A,ETPA)、蓝刺头多糖B(EchinopslatifoliusTausch polysaccharide B,ETPB)、蓝刺头多糖C(EchinopslatifoliusTausch polysaccharide C,ETPC),将各洗脱分离组分浓缩至浸膏状,冷冻干燥成粉末备用。1.3.2总还原能力的测定在试管中分别加入2.5 mL/管pH值6.6的PBS溶液,再加入0.01 g/mL的铁氰化钾溶液1 mL,混匀后分别加入不同的蓝刺头多糖1 mL并充分摇匀,各多糖浓度分别为0.50,1.00,1.50,2.00,2.50,3.00 mg/mL,对照组加入相同浓度的葡萄糖溶液,50 ℃水浴保温静置20 min,待冷却后迅速加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL,摇匀后吸取2 mL于另一试管中,加入0.1 g/mL的三氯化铁溶液1 mL,混匀静置10 min后于700 nm处检测吸光值,总还原能力以吸光度值表示。

1.3.3体外清除DPPH有机自由基的能力参照王华等[6]的报道,略作调整。分别取100 μL的蓝刺头多糖与2×10-4mol/L DPPH液100 μL于96孔板中,各多糖浓度分别为0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL,对照组加入相同浓度的葡萄糖溶液,中速混匀5 min,避光反应30 min后测定525 nm处吸光度(Ai)。与此同时也分别测定100 μL 95%乙醇加100 μL DPPH后的吸光度(Ac)和100 μL待测液加100 μL 95%乙醇后的吸光度(Aj)。

结果计算:清除率=(1-(Ai-Aj)/Ac)×100%

1.3.4体外清除羟基自由基的能力按照南京建成试剂盒操作说明执行。

结果计算:清除率=(A0-(Ai-Ax))/A0×100%1.3.5体外抗菌试验抑菌圈直径的测定:按照常规方法制备无菌营养琼脂培养基,每个培养皿20 mL,待琼脂冷却凝固后,将定植过的1×106cfu/mL的供试菌液取1 mL,均匀涂布在培养基上,后放置4个灭菌牛津杯,各加入10 mg/mL 的多糖溶液200 μL,置37 ℃培养箱中培养24 h,观察抑菌效果。游标卡尺测量抑菌环直径,并评价其抑菌效果。每个浓度的药物抑菌试验重复3次,抑菌结果为3次试验平均值。判定标准:抑菌圈直径≤8.0 mm为不敏感,8.1～13.0 mm为低度敏感,13.1～19.0 mm为中度敏感,>19.0 mm为高度敏感[7]。

最小抑菌浓度的测定:采用微量稀释法进行。96孔细胞培养板中,依次加入用培养基倍比稀释的各蓝刺头多糖溶液,每孔200 μL,最后一孔仅加培养基和细菌作为对照孔,然后在每孔中加入稀释菌液50 μL,此时孔中各蓝刺头多糖浓度分别为 5.00,2.50,1.25,0.62,0.31,0.16 mg/mL,置于微型振荡混匀机上振荡混匀1 min,于37 ℃恒温培养箱中培养18 h,眼观无细菌生长孔所含最低药物浓度即为最小抑菌浓度。试验重复3次,求平均值。

蓝刺头多糖体外抑菌率的测定:使用比浊法将供试菌浓度调至1×104cfu/mL的细菌溶液后,用MTT法检测各蓝刺头多糖的体外抑菌率,试验方法参照许颖等[8]的方法。

1.3.6数据分析数据处理采用Excel软件进行初步整理后使用SAS 9.0进行统计分析。

2　结果与分析

2.1蓝刺头多糖总还原能力的测定结果

由表1可知，随着添加浓度的增大，各蓝刺头多糖的总还原能力均逐步增强。在相同浓度条件下，蓝刺头粗多糖的总还原能力显著高于蓝刺头多糖A(P<0.05)，极显著高于蓝刺头多糖B、C及对照组(P<0.01)，蓝刺头多糖A显著高于蓝刺头多糖B、C及对照组(P<0.05)，蓝刺头多糖B、C同对照组比较差异不显著(P>0.05)。由此看出，在试验剂量范围内，蓝刺头粗多糖的总还原能力最强，其次为蓝刺头多糖A，蓝刺头多糖B和C的总还原能力最弱。

表1　蓝刺头多糖总还原能力的测定结果

注:同列数据注“*”表示差异显著(P<0.05),“**”表示差异极显著(P<0.01)。表2-3同。

Note:Date in a column with “*” indicate significant difference (P<0.05),with “**” indicate extremely significant difference(P<0.01).The same as Tab.2-3.

2.2蓝刺头多糖体外清除DPPH有机自由基能力的测定结果

由表2可知，随着添加浓度的增大，蓝刺头粗多糖和蓝刺头多糖A的体外清除DPPH有机自由基能力均逐渐增加，蓝刺头多糖B和C组无明显变化。在相同浓度条件下，蓝刺头粗多糖组显著高于蓝刺头多糖A(P<0.05)，极显著高于蓝刺头多糖B、C组和对照组(P<0.01)，蓝刺头多糖A组同蓝刺头多糖B、C组和对照组比较差异显著(P<0.05)，蓝刺头多糖B、C组和对照组比较有增高的趋势，但组间差异不显著(P>0.05)。由此看出，在试验剂量范围内蓝刺头粗多糖具有较好的体外清除DPPH有机自由基的能力，蓝刺头多糖A的体外清除DPPH有机自由基能力较弱，而蓝刺头多糖B和C无显著的清除DPPH有机自由基的能力。

表2　蓝刺头多糖体外清除DPPH有机自由基能力的测定结果

2.3蓝刺头多糖体外清除羟基自由基能力的测定结果

由表3可知，随着添加浓度的增大，各蓝刺头多糖的体外清除羟基自由基能力均逐渐增加。当添加浓度为0.1～0.3 mg/mL时，蓝刺头粗多糖和蓝刺头多糖A组同对照组比较差异不显著(P>0.05)，蓝刺头多糖B组显著低于对照组(P<0.05)，蓝刺头多糖C组极显著低于对照组(P<0.01)。当添加浓度为0.4 mg/mL时，蓝刺头多糖C组极显著低于对照组(P<0.01)，其他各组同对照组比较差异不显著(P>0.05)。当添加浓度为0.5 mg/mL时，蓝刺头粗多糖显著高于对照组(P<0.05)，蓝刺头多糖A和B组同对照组比较差异不显著(P>0.05)，蓝刺头多糖C组显著低于对照组(P<0.05)。由此可知，在试验剂量范围内蓝刺头粗多糖体外清除羟基自由基能力最强，其次为蓝刺头多糖A和B，蓝刺头多糖C的体外清除羟基自由基能力最弱。

表3　蓝刺头多糖体外清除羟基自由基能力的测定结果

2.4蓝刺头多糖体外抗菌活性研究

2.4.1蓝刺头多糖抑菌圈直径测定由表4可知,各多糖添加浓度为10 mg/mL时,蓝刺头粗多糖和蓝刺头多糖A体外对大肠杆菌的低度敏感(抑菌圈直径≥8 mm),对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和沙门氏菌不敏感(抑菌圈直径<8 mm)。蓝刺头多糖B和C对上述4种菌均不敏感(抑菌圈直径<8 mm),其中蓝刺头多糖A对铜绿假单胞菌无抑制作用。

表4　蓝刺头多糖抑菌圈直径测定结果

2.4.2蓝刺头多糖最小抑菌浓度测定由表5可知,蓝刺头粗多糖与蓝刺头多糖A对大肠杆菌的抑菌作用强于蓝刺头多糖B和C,最低抑菌浓度均为0.62 mg/mL,蓝刺头多糖B和C的最小抑菌浓度均为1.25 mg/mL;蓝刺头粗多糖对金黄色葡萄球菌抑菌作用强于其他多糖,最低抑菌浓度为1.25 mg/mL，其他3种多糖的最低抑菌浓度均为2.5 mg/mL;各蓝刺头多糖组对铜绿假单胞菌抑制作用均较弱,其中蓝刺头多糖A对该菌无明显抑制作用,其余3种多糖对该菌的最小抑菌浓度为5.00 mg/mL;各蓝刺头多糖中蓝刺头多糖B对沙门氏菌抑制作用最强,最低抑菌浓度为1.25 mg/mL,其次为蓝刺头粗多糖和蓝刺头多糖A对沙门氏菌的抑制作用较低,最低抑菌浓度为2.50 mg/mL,蓝刺头多糖C对沙门氏菌的抑菌作用较弱，最低抑菌浓度为5.0 mg/mL。

表5　蓝刺头多糖最小抑菌浓度测定

3　讨论与结论

3.1蓝刺头多糖体外抗氧化活性

自由基,又名“游离基”,是机体组织细胞正常生理代谢过程中产生的一种含有一个不成对电子的原子团,是一种活性氧,化学性质活泼,具有较强的氧化能力,可导致细胞、蛋白以及核酸的氧化损伤。如若不能及时有效地控制自由基的浓度,清除机体内游离基,则会使机体氧化应激机制启动,严重者导致各个系统的生理功能紊乱、促使细胞破裂、凋亡、癌变等。许多研究证明,导致人类癌症、糖尿病、老年痴呆以及帕金森等疾病以及衰老死亡生理过程的罪魁祸首就是活性氧自由基[9-11]。而多糖作为天然植物提取物,许多研究均表明植物多糖具有较强的抗氧化活性,如:张志军等[12]研究报道,灵芝多糖具有较强的体外清除自由基能力与还原能力,且通过试验证明灵芝多糖的这种抗氧化能力与其添加计量呈正相关,具有剂量效应关系。罗旭艳等[13]研究报道，杨桃根多糖能够明显地抑制羟基自由基和超氧阴离子自由基的生成。尚晓娅等[14]研究报道，绞股蓝多糖具有较强的还原能力,能够有效地清除羟基自由基和DPPH有机自由基。目前研究者们认为多糖类物质的抗氧化机制主要为:多糖碳链上的氢原子与机体内自由基结合脱水,反应产生的单电子继续氧化变成过氧自由基后分解[9]；多糖与机体代谢产生的活性氧或金属离子螯合,使氧化终止[15]；提高机体内自身的抗氧化酶的活性,使其活性增强,从而起到抑制氧化的目的[16]；多糖通过提高机体免疫能力而提高机体的抗氧化、抗衰老作用[17]。本试验结果显示,蓝刺头多糖作为天然植物多糖也具有多糖类物质普遍具有的还原性、清除DPPH有机自由基以及清除羟基自由基活性,并且显示蓝刺头多糖的这些生物活性与其添加量具有剂量效应关系,通过试验可知，在试验条件下，蓝刺头粗多糖的体外抗氧化能力要优于分离纯化后的蓝刺头多糖A、B和C，由此看出，蓝刺头多糖可直接与游离自由基结合,使其活性降低的主要成分在蓝刺头多糖A中,并且证明作为抗氧化剂蓝刺头粗多糖的抗氧化活性更佳。

3.2蓝刺头多糖体外抗菌活性

天然植物提取物抗菌效力的测定对于天然植物活性成分的研究与开发具有十分重要意义。而药敏试验因其直观、灵敏等优点已经成为抗菌药物研究与植物抗菌成分的研究中的经典方法,目前所用的药敏试验方法包括扩散法、稀释法和联合药敏试验等。而此方法中将细菌对试验药物的敏感性分为高敏(抑菌圈直径>19 mm)、中敏(抑菌圈直径为13 mm

蓝刺头多糖具有较强的还原能力以及清除羟基自由基和DPPH有机自由基的能力。其中以蓝刺头粗多糖的抗氧化能力最强,且呈剂量效应关系。其次蓝刺头多糖A具有较好的抗氧化能力。而蓝刺头粗多糖及其洗脱纯化组分蓝刺头多糖A、B、C均无较显著的体外抗金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌以及沙门氏菌活性,蓝刺头粗多糖和蓝刺头多糖A具有一定的抗大肠杆菌活性。

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Study on Antioxidant and Antibacterial Activity in vitro ofEchinopslatifoliusTausch Polysaccharides

YANG Bin1,SA Ruli2,ZHANG Yuemei1,DALAI Baolige1,SONG Yue1,SONG Aijun1,CHEN Wei1,LU Yan1,LIU Min1,YANG Ying3,ZHAO Shihua1

(1.Institute of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Huhhot010031,China;2.College of Animal Science,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot010018,China;3.College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China)

In this study antioxidant activity and antibacterial activity ofEchinopslatifoliusTausch polysaccharides was researched.The result showed that when the initial concentrations were same,ETCP has a highest effect of total reducing capacity,clearance of DPPH free radicalinvitro,higher than ETPA,significantly higher than ETPB and ETPC.When the added concentrations were 0.1-0.3 mg/mL,ETCP has a little higher scavenging effects on free radicals than that of ETPA,but no obvious difference;when the added concentrations were 0.4 mg/mL,ETCP has a little higher scavenging effects on free radicals than that of ETPA,ETPA has a little higher scavenging effects than that of ETPB,and difference were not significant,they were significantly higher than that ETPC,when the added concentrations were 0.5 mg/mL,ETCP has a higher scavenging effects on free radicals than that of ETPA,ETPB,significantly higher than ETPC.Experimental condition,ETCP and ETPA were less sensitive toE.coli,the minimal inhibitory concentration(MIC) were 0.62 mg/mL,ETPB and ETPC were insensitive the MIC were 1.25 mg/mL;ETCP,ETPA,ETPB and ETPC were insensitive toStaphylococcusaureus,the MIC were 1.25,2.50,2.50,2.50 mg/mL respectively;ETCP,ETPB and ETPC were insensitive toPseudomonasaeruginosa,the MIC were 5.00 mg/mL,ETPA had no inhibition toPseudomonasaeruginosa;ETCP,ETPA,ETPB and ETPC were insensitive to Salmonella,the MIC were 2.50,2.50,1.25,5.00 mg/mL respectively.It means ETCP has the strongest antioxidant effect and secondly for ETPA,ETPB and ETPC were weak.ETCP and ETPA has a certain resistance to activity ofE.coli,and ETPA,ETPB and ETPC has no antibacterial action toStaphylococcusaureus,PseudomonasaeruginosaandSalmonella.

EchinopslatifoliusTausch;Polysaccharide;Antioxidant activity;Antibacterial activity

2016-01-05

内蒙古自治区自然科学基金项目(2016BS(LH)0301);内蒙古农牧业创新基金项目(2013CXJJM05)

杨斌(1984-),男,内蒙古锡林浩特人,助理研究员,博士,主要从事家畜普通病防控研究。

赵世华(1962-),男,内蒙古乌兰察布人,研究员,主要从事动物疫病防控研究。

S853.74

A

1000-7091(2016)04-0233-06

10.7668/hbnxb.2016.04.036