益气血补肝肾方对胚胎着床障碍小鼠子宫内膜整合素β3和胞饮突表达的影响

李海霞，夏正明，张金玉，郭新宇，邓伟民，夏薇，盛立红

（1.广州市第一人民医院生殖医学中心，广东广州　510180；2.广州医科大学附属第二医院，广东广州　510260；3.广州军区广州总医院生殖医学中心，广东广州　510010）

益气血补肝肾方对胚胎着床障碍小鼠子宫内膜整合素β3和胞饮突表达的影响

李海霞1，夏正明2，张金玉3，郭新宇3，邓伟民3，夏薇1，盛立红1

（1.广州市第一人民医院生殖医学中心，广东广州510180；2.广州医科大学附属第二医院，广东广州510260；3.广州军区广州总医院生殖医学中心，广东广州510010）

【目的】观察中药益气血补肝肾方对胚胎着床障碍小鼠子宫内膜整合素β3表达的影响，探讨其改善胚胎着床的分子基础。【方法】将90只雌鼠随机分为正常组、模型组和治疗组3组，每组30只，其中，治疗组小鼠予以中药益气血补肝肾方治疗（包括经后增殖方8 mg/kg和促黄体方8 mg/kg），在妊娠第4天（Pd4）上午8∶00采用米非司酮诱导模型组和治疗组小鼠胚胎着床障碍，12 h后处死小鼠（每组20只），剖腹取小鼠子宫，小心刮取子宫内膜，采用Real-time PCR和Western Blot的方法分别在mRNA和蛋白水平上检测整合素β3在各组小鼠子宫内膜中的表达情况。其余小鼠（每组10只）于Pd4剖腹取小鼠子宫，固定于体积分数2.5%戊二醛溶液中，行扫描电镜观察。【结果】Real-time RT-PCR和Western Blot结果显示：模型组整合素β3 mRNA与蛋白表达显著低于正常组（P＜0.05）；治疗组可显著升高整合素β3 mRNA与蛋白表达水平，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。胞饮突在模型组中的表达少于治疗组和正常组，而胞饮突在治疗组和正常组的表达相似。【结论】中药益气血补肝肾方可上调子宫内膜中整合素β3的表达，对胞饮突在Pd4小鼠子宫内膜中的表达有正调节作用。

益气血补肝肾方；整合素β3；胞饮突；子宫内膜容受性；胚胎着床；子宫/超微结构；疾病模型，动物；小鼠

随着辅助生殖技术的发展，受精率逐渐提高，而胚胎的着床率和临床妊娠率却长期得不到很好的提高。胚胎着床的低效性使助孕技术的发展进入了“瓶颈期”，影响了辅助生殖技术的进一步发展，胚胎着床是影响不孕症患者治疗结局的重要环节［1］。众所周知，着床期子宫内膜容受性的建立是影响胚胎种植率和临床妊娠率的一个重要因素［2］。近年来，中医中药在辅助生殖技术中发挥着越来越重要的作用，并在实际的临床工作中逐渐显现出成效［3］。本研究通过建立着床障碍的小鼠模型，观察中药益气血补肝肾方对着床障碍小鼠围着床期子宫内膜整合素β3和胞饮突表达的影响，进一步阐明益气血补肝肾方改善子宫内膜容受性以促进胚胎着床的分子基础，现报道如下。

1　材料和方法

1.1主要药物、试剂与仪器益气血补肝肾方（包括经后增殖方和促黄体方），由广东一方制药厂生产。其中，经后增殖方（批号：Q1201005）含有：炙甘草6 g、党参15 g、当归6 g、川芎6 g、白芍12 g、白术12 g、茯苓12 g、菟丝子15 g、熟地黄12 g、杜仲15 g、鹿角霜10 g、山萸肉10 g、川椒3 g，煎成20 mL，制成颗粒剂10 g，相当于生药量134 g；促黄体方（批号：Q1203026）含有：熟地黄15 g、山药15 g、枸杞子15 g、山萸肉10 g、菟丝子15 g、鹿角胶10 g、龟板12 g、党参15 g、白术15 g、扁豆15 g、薏苡仁15 g、茯苓15 g，煎成20 mL，制成颗粒剂10 g，相当于生药量167 g；将米非司酮片（湖北葛店人福药业有限责任公司生产，批号：150703）碾碎，溶解于丙二醇（国产分析纯）中，配成浓度为0.8 mg/mL的悬混液。整合素β3单克隆抗体购自美国 Abcam公司（批号：ab75872）；整合素β3引物由上海生工公司设计合成。ABI PRISM7900荧光定量PCR仪为美国Bio-Rad公司产品。

1.2动物模型复制［4-5］及处理SPF级昆明小鼠，雌性小鼠未交配，雄性小鼠证明有生育能力，鼠龄6～8周，体质量20～25 g，由本院动物实验中心提供，动物合格证号：0060092/0060933。雌雄分笼饲养，小鼠被适应性饲养7 d后，进入实验阶段，自然光照，自由取水和摄食。将符合条件的雌鼠随机分为3组：正常组、模型组和治疗组，每组30只。每日17∶00按雌雄比2∶1合笼，次日晨8∶00检查雌鼠阴栓，发现阴栓者记为妊娠第1天（Pd1），依次计算妊娠天数。从进入实验开始，治疗组每日上午给予经后增殖方灌胃（剂量为8 mg/kg），从Pd1开始，改为促黄体方灌胃（剂量为8 mg/kg）。正常组和模型组则灌服等体积生理盐水。于Pd4 8∶00在治疗组和模型组小鼠颈背部皮下注射米非司酮0.1 mL/只（0.8 mg/mL），正常组则注射等容积丙二醇。12 h后将小鼠60只（每组20只）颈椎脱臼处死小鼠，剖腹取小鼠子宫，小心剥离子宫内膜，须在解剖显微镜下剔除着床点胚胎；然后刮取蜕膜化的子宫内膜，立即放入事先经高压消毒的微量离心管（Eppendorf，EP）中。每只小鼠的子宫内膜装进1个EP管，－80℃保存备用。其余小鼠30只（每组10只），于Pd4剖腹取小鼠子宫，以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，纵形剖开，固定于体积分数2.5%戊二醛溶液中，行扫描电镜检查。

1.3实时荧光定量RT-PCR检测

1.3.1总RNA提取常规Trizol法提取总RNA，按说明书要求进行。各组小鼠子宫内膜总RNA以一定比例稀释，在紫外分光光度计上检测其纯度，D260/D280比值为1.8～2.0。各组总RNA保存于－70℃备用。

1.3.2逆转录反应采用逆转录酶合成整合素β3 cDNA第一链。反应体系：总体系20 μL。取RNA模板1 μL于微量离心管中，依次加入5×RT Buffer 4 μL，脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）mix 2 μL，Oligo（dT）181 μL，RiboLockTMRnaseInhibitor1μL，ReverTra Ace 1 μL，加Rnase free water至20 μL，轻混匀，稍离心。反应条件：65℃、5min，42℃、60 min，70℃、10 min。所得cDNA第一链保存在-20℃备用。

1.3.3实时荧光定量RT-PCR检测整合素β3 mRNA的表达将逆转录所得的cDNA按1∶10稀释，依次加入以下反应体系：SYBR Green Qpcr SuperMix-UDC 5 μL，Forward primer 0.2 μL，Reverse primer 0.2 μL，焦碳酸二乙酯（DEPC）-treated water 2.6 μL，cDNA 2 μL。引物序列：整合素β3引物：上游引物5'-TTCAATGCCACCTGCCTCAA-3'，下游引物5'-CCTTGGCCTCGATACTAAAGCTCA-3' （100 bp）；内参照 β-actin引物：上游 5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3'，下游5'-TCG GGG CAT CGG AAC CGC TCA-3'（404 bp）。PCR反应条件为：50℃、2 min，灭活UTG活性，95℃、10 min，酶热启动，95℃、15 s变性，60℃、1 min，退火及延伸，35个循环。根据各组样品的荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数（Ct值），通过标准曲线计算各样本的模板拷贝数。以整合素β3 mRNA/β-actin mRNA的拷贝数之比值（p）表示实验结果。

1.4免疫印迹分析法将适量小鼠子宫内膜组织置于匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。加入含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的三去污裂解液400 μL于匀浆器中冰上匀浆，并重复碾磨，使组织尽量碾碎；裂解30 min后，用移液器将裂解液转移至1.5 mL离心管中；然后在4℃下12 000 r/min，离心5 min，取上清提取蛋白。用考马斯亮兰法测定蛋白浓度后，各组样品（分别取50 μg蛋白），以100 mg/L十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，350 mA进行恒流电转移1 h，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜（PVDF膜）上。再根据滤膜面积以0.1 mL/cm2的量加入含50 g/L脱脂奶粉的 Tris-HCl缓冲盐溶液（TBST，含体积分数0.1%Tween-20）封闭，室温1 h。加入用50 g/L脱脂奶粉的TBST稀释的一抗，室温振摇，与膜共同孵育1 h，然后4℃过夜（兔抗整合素β3单克隆抗体浓度为1∶200，兔抗β-actin单克隆抗体浓度为1∶500）。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗，与膜共同孵育1 h，室温振摇（兔抗鼠多克隆抗体浓度为1∶1 000、羊抗兔多克隆抗体浓度为1∶3 000），充分洗涤后采用电化学发光法（ECL）显影曝光。用Bio-Rad图像分析系统对目的条带进行光密度扫描，然后用Quantity One软件进行分析，以整合素β3/β-actin相对光密度值（p）作为整合素β3蛋白的相对表达值。

1.5扫描电镜观察子宫内膜胞饮突各组小鼠于Pd4剖腹取子宫，PBS冲洗，纵形剖开，固定于体积分数2.5%戊二醛溶液中，行扫描电镜观察小鼠子宫内膜胞饮突的表达。

1.6统计方法采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差（±s）表示。组间均数比较采用t检验法；组内均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1各组实时荧光定量RT-PCR实验结果图1结果显示：模型组Pd4整合素β3 mRNA表达显著低于正常组（P＜0.05）；治疗组可显著升高整合素β3 mRNA表达水平，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1　各组小鼠Pd4子宫内膜中整合素β3 mRNA的表达比较Figure 1　Endometrial integrin β3 mRNA expression level in the mice of different groups on Pd4　（±s，N=3）

2.2各组免疫印迹结果图2、图3结果显示：模型组整合素β3蛋白表达较正常组显著降低（P＜0.05）；治疗组可显著升高整合素β3蛋白表达，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2　各组整合素β3蛋白表达凝胶电泳图Figure 2　Endometrial integrin β3 protein expression level in the mice of different groups detected by gel electrophoresis

图3　各组小鼠Pd4子宫内膜中整合素β3蛋白的表达比较Figure 3　Gel electrophoresis results of endometrial integrin β3 protein expression in the mice of different groups on Pd4　（±s，N=3）

2.3胞饮突在各组小鼠子宫内膜中的表达图4结果显示：胞饮突在模型组中的表达少于治疗组和正常组，而胞饮突在治疗组和正常组的表达相似。提示益气血补肝肾方对胞饮突在Pd4小鼠子宫内膜中的表达有正调节作用，可改善子宫内膜容受性，促进胚胎着床。

3　讨论

3.1整合素β3、胞饮突与子宫内膜容受性胚胎着床是许多物种生殖过程中最关键的环节。成功的着床需具备有接受性的子宫内膜、正常并具有发育潜能的胚胎以及母—胎界面的对话。在胚胎着床的窗口期，子宫在一个极短的时期允许胚胎着床，在人类，这一时期相当于月经周期的第20～24天，即子宫在这一特定时期对胚胎具有接受性。子宫内膜容受性的建立是其中的一个重要环节［6］。

图4　各组Pd4小鼠子宫内膜胞饮突表达比较（扫描电镜，×5 000）Figure 4　Observation of the formation of pinopodes in mice endometrium of different groups at Pd4 under scanning electron microscope（×5 000）

整合素分子是一组由多种跨膜糖蛋白受体组成的家族，广泛存在于细胞表面，可介导细胞与细胞外基质及细胞与细胞之间的粘附，并参与细胞内外信息传递。研究［7］证实，整合素β3在子宫内膜的表达呈高度时空特异性，分泌中晚期，表达于子宫内膜腺上皮，此时恰与人植入窗期一致，子宫内膜容受性最佳。Lessey等［8］研究发现，整合素β3在着床窗的出现与子宫内膜孕激素受体（PR）表达调节有关。国外学者通过对66名妇女接受体外受精与胚胎移植（IVF-ET）前后子宫内膜行整合素β3检测发现，经IVF-ET术后妊娠的妇女子宫内膜整合素β3的表达显著高于非妊娠组。提示种植窗期子宫内膜整合素β3表达减少所导致的子宫内膜容受性低下，是IVF-ET失败的原因之一［9］。胚胎和子宫内膜的同步发育与相互协调对于胚胎的植入是至关重要的。其中子宫内膜容受性是一个关键性的因素。Srinivasan等［10］采用免疫组织化学、免疫细胞化学及流式细胞学检测整合素β3在小鼠子宫内膜上皮细胞中表达，进一步证实了整合素β3是子宫内膜容受性的标志，并且是胚胎着床过程中所不可缺少的。Lessey等［8］认为，整合素有助于子宫内膜由非粘附到粘附状态的转变，为胚泡的粘附、植入做准备。此外，植入期滋养层的侵入性受整合素表达或分布的影响。认为整合素β3除影响子宫内膜容受性外，还能决定胚胎滋养层细胞的侵入能力。整合素的异常表达与子宫内膜容受性缺陷有关。更为特异的是，经治疗后最终成功妊娠的患者在分泌期整合素β3的表达显著增高，支持整合素β3作为子宫内膜容受性分子标记一说［11］。

胞饮突（pinopode）是在扫描电子显微镜（scanning electronic microscopy，SEM）下可见的子宫内膜上皮细胞表面大而平滑的泡状突起，由Nelson首先在小鼠子宫内发现。有研究证实，胞饮突出现的时间与“种植窗”出现的时间相吻合，且表达在囊胚着床的部位，参与了胚胎着床的过程，为子宫内膜容受性的形态学标志。胞饮突的出现时间与子宫内膜“着床窗”出现的时间相吻合，为子宫内膜容受性的形态学标志［2，12］。

3.2益气血补肝肾方改善着床障碍小鼠子宫内膜的容受性中药治疗不孕有悠久的历史，中医对各种原因的不孕症有不同的辨证论治方法。益气血补肝肾方中的经后增殖方着重于益气血，同时促进子宫内膜的的正常生长，方中用黄芪、党参、白术、茯苓、甘草健脾益气，熟地黄、肉桂、当归、白芍、川芎补血和血，全方使气血旺盛，冲任得滋，胎孕易成。促黄体方着重于补肝肾。当妇女受孕后，胎元的健康成长就需要肾水的封藏功能和脾土承载功能的正常运行，故此期的治疗主要着重于补肝滋肾水兼以健脾，使雌激素及孕酮维持较高水平，调补肝肾为主，以维持黄体功能，促使胚胎的着床。全过程先补益气血，后滋补肝肾，共达调经种子之效［13］。现代研究发现许多中药能兴奋下丘脑—垂体—性腺系统，显示激素样作用，能改善组织供血及子宫内膜的微环境，增强子宫内膜的容受性，提高着床率及临床妊娠率。经后增殖方及促黄体方中的许多中药都有这样的功效，研究［14-15］表明，益气血补肝肾方能显著提高卵泡液转化生长因子β1（TGF-β1）和促黄体生成素（LH）水平，能适当提高垂体降调节后人绒毛膜促性腺激素（HCG）日的LH水平，减少促性腺激素（Gn）用量和使用天数，从而提高胚胎的着床率。前期的研究［16］表明，经后增殖方及促黄体方能诱导超促排卵小鼠子宫内膜整合素β3的表达，提高超促排卵小鼠的胚胎着床率，提示该方可能具有改善子宫内膜容受性的作用。

本研究中，采用米非司酮建立胚胎着床障碍的小鼠模型，旨在研究中药益气血补肝肾方对着床障碍小鼠围着床期子宫内膜整合素β3表达的影响，从而阐明其改善胚胎着床的分子基础，为临床实践提供更充分的理论依据。实时荧光定量RT-PCR结果显示：经米非司酮的作用，在Pd4模型组小鼠子宫内膜整合素β3 mRNA的表达较正常组显著降低，治疗组可显著升高整合素β3 mRNA的表达，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。免疫印迹检查结果显示整合素β3的表达趋势与实时荧光定量RT-PCR结果无显著性差异。本研究结果提示：中药益气血补肝肾方可上调着床障碍小鼠围着床期子宫内膜中整合素β3及胞饮突的表达，改善子宫内膜容受性，使内膜与胚胎趋于同步化，从而促进胚胎着床。

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【责任编辑：黄玲】

Effect of Yiqixue Buganshen Recipe on Endometrial Integrin β3 Expression and Pinopode Formation in Mice with Embryo Implantation Dysfunction

LI Haixia1，XIA Zhengming2，ZHANG Jinyu3，GUO Xinyu3，DENG Weimin3，XIA Wei1，SHENG Lihong1
（1.Medical Reproduction Center，Guangzhou First People's Hospital，Guangzhou 510000 Guangdong，China；2.The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000 Guangdong，China；3.Medical Reproduction Center，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region，Guangzhou 510000，Guangdong，China）

ObjectiveTo observe the effect of Yiqixue Buganshen Recipes（YBR），the compound recipes of Chinese herbal medicine with the actions of replenishing Qi and blood and tonifying liver and kidney，on the endometrial integrin β3 of the mice with embryo implantation dysfunction，and to explore the molecular mechanism of YBR in improving embryo implantation.Methods Ninety mice were divided normal group，model group，and YBR group，30 mice in each group.YBR group was given Jinghou Zengzhi granules 8mg/kg for promoting post-menstruation proliferation and Cuhuangti granules 8mg/kg for promoting the formation of corpora luteum.At 8∶00 am of pregnant day 4（Pd4），subcutaneous injection of mifepristone was used for inducing embryo implantation dysfunction in the model group and YBR group.Twenty mice from each group were executed 12 hours after subcutaneous injection of mifepristone，and the uterus was isolated for the detection of mice endometrial integrin β3 mRNA and protein expression with real-time RT-PCR and Western blotting method respectively.Ten mice from each group at Pd4 were executed，and the uterus was isolated and then fixed in 2.5%glutaraldehyde solution for the detection of the formation of pinopode in mice endometrium under scanningelectron microscope.Results The detection by real-time PCR and Western blotting method revealed that integrin β3 mRNA and protein expression levels of the model group were significantly lower than those of the normal group（P＜0.05），and YBR group had higher integrin β3 mRNA and protein expression levels than the model group（P＜0.05）.The formation of pinopodes in the model group was less than the normal group and YBR group，but the number of formed pinopodes in YBR group was similar to that in the normal group.Conclusion YBR can up-regulate the expression of integrin β3 in the endometrium of mice with embryo implantation dysfunction，and have positive regulatory effect on the formation of pinopodes on Pd4.

Yiqixue Buganshen Recipe；integrin β3；pinopode；endometrial receptivity；embryo implantation；uterus/ultrastructure；disease models，animal；mice

R285.5

A

1007-3213（2016）05-0688-05

10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．05．017

2016-05-01

李海霞（1978-），女，硕士研究生，主治医师；E-mail:278941085@qq.com

张金玉（1965-），女，主任医师；E-mail:haixialitj@sina.com

国家自然科学基金资助项目（编号:30973929）；国家青年科学基金资助项目（编号:81403249）；广东省中医药管理局课题（编号:20141045）