苍山黑龙溪旱季和雨季水生丝孢菌资源比较研究

王如潇，刘晓英，罗宗龙，李　卓，王立伟，苏鸿雁*

（1.大理大学基础医学院，云南大理　671000；2.大理大学农学与生物科学学院，云南大理　671003）

苍山黑龙溪旱季和雨季水生丝孢菌资源比较研究

王如潇1，刘晓英1，罗宗龙2，李卓2，王立伟2，苏鸿雁2*

（1.大理大学基础医学院，云南大理671000；2.大理大学农学与生物科学学院，云南大理671003）

目的：调查黑龙溪中水生丝孢菌资源并比较其在旱季和雨季有何异同。方法：2013年3月和7月从黑龙溪中采集沉水腐木各50份，采用保湿培养法对水生真菌进行培养，基于形态学特征对水生真菌进行鉴定。结果：共分离鉴定出48种水生丝孢菌，旱季30种，雨季23种，旱季和雨季共有种5种，共有种分别为Ellisembia bambusicola、Helicosporium guianense、Helminthosporium velutinum、Phaeoisaria clematidis、Rhinocladiella schulzerii。旱季水生丝孢菌多样性指数明显高于雨季水生丝孢菌多样性指数（3.67 vs 2.32）。结论：黑龙溪中水生丝孢菌的多样性与季节变化有关，旱季中获得的水生丝孢菌更多。

水生丝孢菌；黑龙溪；旱季；雨季；沉水腐木

［DOI］10. 3969 / j. issn. 2096-2266. 2016. 06. 015

水生真菌中子囊菌及其无性型种类繁多，而淡水无性型真菌的形态多样〔1〕。SHEARER等〔2〕将淡水无性型真菌划分为3类，分别是水生丝孢菌、需气水生丝孢菌和其他水生丝孢菌。已有研究表明，水生真菌在水生生态系统中扮演着重要的角色，而作为水生真菌一大类群的水生丝孢菌在水生生态系统中也发挥着重要作用〔3〕。从1942年INGOLD报道第一个水生丝孢菌至今已有七十多年历史〔4〕，有大量的水生丝孢菌被发现，在中国发现并报道的就有416种，其中98种来自云南〔5〕。

在热带和温带地区已有关于真菌的季节性发生的研究，其研究对象主要是小溪中腐叶上的真菌〔6〕。也有关于腐木上真菌的季节性发生的研究〔7〕。NIKOLCHEVA等〔8〕采用传统的形态学和分子生物学相结合的方法研究季节与水生丝孢菌多样性的相关性。HO等〔9〕研究湿热干冷气候对大埔滘中沉水腐木上真菌群落的影响。余永年等〔10〕对北京地区水霉科真菌的季节性分布进行了调查研究。云南省也有相关报道，杨发蓉、丁骅孙、罗晶等〔11-14〕学者对滇池、洱海、程海水体中的水生真菌类群分布以及其多样性与季节变化的相关性进行了研究。

苍山位于南亚热带和中亚热带交汇处，受水平和垂直地带性气候的双重影响，生物具有明显的多样性特征。苍山东坡历年各月平均气温，最热月和最冷月均出现在7月和1月，7月平均最高温为24.5℃。苍山降雨丰富，年均降雨量1 851.6 mm，其中5～10月份的降雨量占全年的84%。东坡年日照数达2 305.8 h，干季（11～4月）平均日照数为6.5 h以上，而雨季（5～10月）平均日照数只有4.4～6.6 h。迄今为止，几乎没有学者对苍山水生丝孢菌资源进行过全面的调查与分类。本项目主要调查黑龙溪中水生丝孢菌资源并比较其在旱季雨季中有何异同。

1　材料和方法

1.1沉水腐木的采集2014年3月和7月分别沿黑龙溪下游往上游随机采集腐木，选择浸泡时间较长，腐烂程度良好，直径1～5 cm、长20～30 cm的腐木各50份。采集好的腐木装入自封塑料袋中，记录采样时间、地点。带回实验室进行保湿培养。

1.2培养基PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL；MEA培养基：麦芽浸膏30 g，大豆蛋白胨3 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL；WA培养基：琼脂条18 g，蒸馏水1 000 mL。以上培养基经高压蒸汽灭菌（121℃，20 min）后冷却至50℃（以不烫手为宜）时加入终浓度为100 μg/mL氨苄青霉素混匀，倒入平板备用。

1.3样品的观察保湿培养1周后，将样品置于GL-99BI连续变倍体视镜下进行观察，在所观察到的目标菌株附近插上大头针作为标记。对所观察到的丝孢菌用Nikon-SMZ1000进行外部形态拍照。以无菌水、甘油等作为浮载剂，对所观察到的真菌进行制片，在OLYMPUS BX51显微镜下进行绘图、拍照、测量。

1.4水生丝孢菌的单孢分离在体式镜下锁定目标菌株，用削尖的无菌牙签将分生孢子挑取下来，转移到WA培养基上，保证每皿至少有7个分生孢子。室温培养，24 h后进行观察，将萌发的孢子转接到PDA培养基或MEA培养基上，用保鲜膜封口，室温培养，另挑取萌发的孢子制片，用OLYMPUS BX51显微镜拍照。以上操作均在无菌条件下进行。定期检查菌落的生长情况，若发现污染及时纯化。

1.5拼图使用Photoshop软件对菌种的外部形态和微观结构图片进行拼图。

1.6形态学鉴定对真菌在基质上的着生情况、菌丝、孢子梗、产孢结构、分生孢子着生情况及分生孢子形态等特征进行鉴定。主要参照相关文献〔15-17〕对所得到的水生丝孢菌进行形态学鉴定。

1.7数据分析本研究采用香农-威纳指数（H）来比较黑龙溪中不同季节的水生丝孢菌多样性。采用辛普森相似指数（S）评估两个季节中水生丝孢菌群落的相似指数，S=0表示不相似，S=1表示完全相似。各参数公式如下所示：

水生丝孢菌检出率（%）=（某个物种检出次数/样品总数）×100%。

式中：Ni=第i个种的检出次数，N=所有种的检出次数，lnPi=Pi的自然对数。

S=2c/a+b，其中，a=黑龙溪中旱季水生丝孢菌种数，b=黑龙溪中雨季水生丝孢菌种数，c=两个季节中共有的水生丝孢菌种数。

2　结果

在这次研究中，共鉴定出48种水生丝孢菌，其中旱季30种，雨季23种。旱季中出现频率较高的种为Helicosporium guianense（14%）、Sporidesmium adscendens（10%）、Helminthosporium velutinum（8%）。雨季中出现频率较高的种为Monodictys cerebriformis （8%）、Phaeoisariaclematidis（8%）、S.sp.（8%）。见表1。

表1　黑龙溪中沉水腐木上水生丝孢菌检出率

续表1

两个季节都出现的有5种，分别是Ellisembia bambusicola、H.guianense、H.velutinum、P.clematidis、Rhinocladiella schulzerii。除了R.schulzerii（2%）的检出率相同外，其余4种的检出率皆不同。黑龙溪中旱季和雨季水生丝孢菌群落的辛普森相似指数为0.19，显示出水生丝孢菌群落在这两个季节的相似性较低。比较两个季节的水生丝孢菌多样性指数旱季水生丝孢菌多样性指数明显高于雨季水生丝孢菌多样性指数（3.67 vs 2.32）。见表2。

表2　黑龙溪中沉水腐木上水生丝孢菌物种数、真菌多样性指数及相似指数

3　讨论

杨发蓉等〔11-13〕在研究中指出，在滇池和洱海中旱季和雨季的水生真菌类群和数量差异较大，旱季的水生真菌类群和数量明显多于雨季。此次研究结果与之相同。水生真菌群落和真菌多样性的影响因素有很多，温度〔18〕、植被〔19-20〕、气候带〔21-23〕、水污染〔24〕、人为干扰〔20〕、真菌生长基质〔25〕等。此次研究选取的研究地点为苍山黑龙溪，气候带和植被对水生丝孢菌多样性的影响不大。有研究显示黑龙溪入湖口水质旱季雨季皆为劣Ⅴ类，出山口水质旱季为Ⅰ类而雨季为Ⅱ类〔26〕，相比较而言，旱季水质较雨季水质要好。已有研究表明，污染对真菌群落结构有影响，而对真菌多样性的影响不大〔20-27〕。雨季中水生丝孢菌多样性和物种数低于旱季可能与降雨频繁有关，旱季水流量少且缓慢，雨季水流量大、流速快，雨水冲刷可能造成游动孢子数量减少或死亡〔13〕。不同季节黑龙溪中水的温度也不同，已有研究证实温度对物种丰富度和多样性有影响〔18〕。实验结果显示黑龙溪中水生丝孢菌在旱季和雨季的相似性较低，并且旱季的多样性指数高于雨季。因此，黑龙溪中水生丝孢菌多样性受季节的影响。

〔1〕胡殿明.淡水粪壳纲及无性型真菌系统学及人为干扰下的淡水真菌多样性研究〔D〕.北京：中国林业科学研究院，2011.

〔2〕SHEARER C A，DESCALS E，KOHLMEYER B，et al. Fungal biodiversity in aquatic habitats〔J〕.Biodiversity and Conservation，2006，16（1）：49-67.

〔3〕KRAUSS G J，SOLÉ M，KRAUSS G，et al.Fungi in freshwaters：ecology，physiology and biochemical potential〔J〕. FEMS Microbiol Rev，2011，35（4）：620-651.

〔4〕INGOLD C T.Aquatic hyphomycetes of decaying alder leaves〔J〕.Transactions of the British Mycological Society，1942，25（4）：339-417.

〔5〕HU D M，LIU F，CAI L.Biodiversity of aquatic fungi in China〔J〕.Mycology：An International Journal on Fungal Biology，2013，4（3）：125-168.

〔6〕BÄRLOCHER F.The ecology of aquatic hyphomycetes〔M〕. Berlin：Springer-Verlag，1992：38-76.

〔7〕LAMORE B J，GOOS R D.Wood-inhabiting fungi of a freshwater stream in Rhode Island〔J〕.Mycologia，1978，70 （5）：1025-1034.

〔8〕NIKOLCHEVA L G，BÄRLOCHER F.Seasonal and substrate preferences of fungi colonizing leaves in streams：traditional versus molecular evidence〔J〕.Environ Microbiol，2005，7（2）：270-280.

〔9〕HO W W H，YANNA，HYDE K D，et al.Seasonality and sequential occurrence of fungi on wood submerged in Tai Po Kau Forest Stream，Hong Kong〔J〕.Fungal Diversity，2002，10：21-43.

〔10〕余永年，梁枝荣.北京地区水霉科真菌季节性分布〔J〕.真菌学报，1983，2（3）：186-197.

〔11〕杨发蓉，杨瑞华，丁骅孙，等.滇池水体中水生真菌类群分布的研究〔J〕.云南大学学报（自然科学版），1985，7 （S1）：85-93.

〔12〕LUO J，YIN J，CAI L，et al.Freshwater fungi in Lake Dianchi，a heavily polluted lake in Yunnan，China〔J〕. Fungal Diversity，2004，16（1）：93-112.

〔13〕杨发蓉，丁骅孙.洱海湖体真菌类群分布的研究〔J〕.云南大学学报（自然科学版），1986，8（3）：319-324.

〔14〕丁骅孙，杨发蓉.程海的真菌〔J〕.云南大学学报（自然科学版），1988，10（4）：370-376.

〔15〕SEIFERT K A，MORGAN-JONES G，GAMS W，et al. The genera of Hyphomycetes〔M〕.Utrecht：CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre，2011：3-997.

〔16〕MATSUSHIMA T.Icones microfungorum a Matsushima lectorum〔J〕.Mycologia，1976（4）：955.

〔17〕ELLIS M B.Dematiaceous hyphomycetes〔M〕.England：Commonwealth Agricultural Bureaux，1971：9-582.

〔18〕SUBERKROPP K.Effect of temperature on seasonaloccurrence of aquatic hyphomycetes〔J〕.Transactions of the British Mycological Society，1984，82（1）：53-62.

〔19〕BÄRLOCHER F，GRACA M A S.Exotic riparian vegetation lowers fungal diversity but not leaf decomposition in Portuguese streams〔J〕.Freshwater Biology，2002，47（6）：1123-1135.

〔20〕TSUI C K M，HYDE K D，HODGKISS I J.Longitudinal and temporal distribution of freshwater ascomycetes and dematiaceous hyphomycetes on submerged wood in the Lam Tsuen River，Hong Kong〔J〕.Journal of the North American Benthological Society，2001，20（4）：533-549.

〔21〕HYDE K D，GOH T K.Fungi on submerged wood in Lake Barrine，north Queensland，Australia〔J〕.Mycological Research，1998，102（6）：739-749.

〔22〕HYDE K D，GOH T K.Fungi on submerged wood from the River Coln，England〔J〕.Mycological Research，1999，103（12）：1561-1574.

〔23〕HO W H，HYDE K D，HODGKISS I J.Fungal communities on submerged wood from streams in Brunei，Hong Kong，and Malaysia〔J〕.Mycological Research，2001，105 （12）：1492-1501.

〔24〕LUO J，YIN J，CAI L，et al.Freshwater fungi in Lake Dianchi，a heavily polluted lake in Yunnan，China〔J〕.Fungal Diversity，2004，16（1）：93-112.

〔25〕SIVICHAI S，JONES E，HYWEL N L.Fungal colonisation of wood in a freshwater stream at Khao Yai National Park，Thailand〔J〕.Fungal Diversity，2000，12（5）：71-88.

〔26〕马根连.云南大理苍山十八溪水质监测评价〔J〕.人民长江，2012，43（12）：68-70.

〔27〕TSUI C K，HYDE K D，HODGKISS I J.Colonization patterns of wood-inhabiting fungi on baits in Hong Kong rivers，with reference to the effects of organic pollution〔J〕. Antonie Van Leeuwenhoek，2001，79（1）：33-38.

〔Abstract〕Objective：To investigate the diversity of freshwater hyphomycetes from Heilong Stream and compare their differences in occurrence during the dry season and rainy season.Methods：50 samples were collected from each season，moist chamber incubation methodwasusedtoincubatethefungiandthefunguswereidentifiedbasedonthemorphologicalcharacters.Results：Atotalof48speciesof freshwater hyphomycetes were identified：30 species from dry season，23 species from wet season.Ellisembia bambusicola，Helicosporium guianense，Helminthosporiumvelutinum，Phaeoisariaclematidis，Rhinocladiellaschulzeriiwerefoundduringboththeseasons.Thediversity index of freshwater fungi at dry season is higher than wet season（3.67 vs 2.32）.Conclusion：The diversity of freshwater hyphomycetes in HeilongStreamcloselyrelatedtotheseasonchangingandmorespeciesdiversitywasobservedduringdryseason.

〔Key words〕freshwater hyphomycetes；Heilong Stream；dry season；wet season；submerged decayed wood

（责任编辑李杨）

Comparative Study of Freshwater Hyphomycetes Resource in Heilong Stream during the Rainy Season and Dry Season in Cangshan Mountain at Dali

Wang Ruxiao1，Liu Xiaoying1，Luo Zonglong2，Li Zhuo2，Wang Liwei2，Su Hongyan2*
（1.Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.College of Agriculture and Biology Science，Dali University，Dali，Yunnan 671003，China）

Q948

A

2096-2266（2016）06-0062-04

国家自然科学基金资助项目（31060019；31460015）；云南省中青年学术带头人资助项目（2012HB042）

2015-11-06

2016-01-14

王如潇，硕士研究生，主要从事微生物及疾病研究.

苏鸿雁，教授.