玉米皮固态培养混合益生菌的研究

2016-09-21刘建玲戴建英修志龙大连理工大学生命科学与技术学院沈阳大连116024

中国饲料 2016年8期

刘建玲，牟　英，戴建英，修志龙（大连理工大学生命科学与技术学院，沈阳大连116024）

玉米皮固态培养混合益生菌的研究

刘建玲，牟英，戴建英，修志龙*
（大连理工大学生命科学与技术学院，沈阳大连116024）

本试验以玉米皮为主要原料，通过单因素试验和正交试验对黑曲霉与酿酒酵母的混合固态培养进行了研究。以蛋白酶、纤维素酶、活菌数为主要考察指标，优化得出的最佳培养条件为：尿素添加量0.5％（P＜0.05）、含水量60％、麸皮添加量15％（P＜0.05）、黑曲霉接种量20％、培养天数7 d；混菌培养接种比（黑曲霉∶酿酒酵母）为3∶1，混菌共培养1 d。在此条件下，纤维素酶的酶活为622.11 U/g，蛋白酶的酶活为606.55 U/g，每克发酵物含益生活菌总数超过百亿。

玉米皮；固态培养；纤维素酶；蛋白酶；益生菌

［Abstract］Solid-state culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae was studied by using corn bran as main material.Single-factor and orthogonal experimentwere used to optimize the nutritional and environmental conditions for improving the activity of protease，cellulase and the number of living cells.The optimized cultivation conditions for As鄄pergillus niger were as follows：urea content 0.5％（P＜0.05），water content 60％，wheat bran adding level 15％（P＜0.05），inoculation amount 20％，cultivation period 7 days.When co-culture of two strains was conducted，the ratio of As鄄pergillus niger to Saccharomyces cerevisiae was 3∶1，and co-culture time was 1 day.Under the above conditions，the cellulase activity reached to 622.11U/g，the protease activity achieved 605.55U/g，and the total number of living probiotic cells reached tomore than ten billion per gram.

［Key words］corn bran；solid-state cultivation；cellulase；protease；probiotics

玉米皮是玉米深加工的副产物，其本身含有大量的纤维素和半纤维素，适口性差，不利于非反刍类家畜消化（王伟伟等，2013）。相关研究通过益生菌固态培养制备蛋白质饲料来提高玉米皮的利用率和营养价值。研究表明，细菌、真菌、放线菌等都能产生纤维素酶（刘洁丽和王靖，2008），其中黑曲霉所产酶系丰富，可产十余种酶类，并且自身也是生物安全菌，动物利用后能促进消化吸收（吕玉丽等，2012）。有研究表明，黑曲霉在培养过程中能水解出过量的还原糖，可以接入酿酒酵母进行混菌培养。酵母菌在培养过程中产生的代谢产物能提高瘤胃中有益菌的数量和活力，调节瘤胃的发酵功能，另外酵母菌还能产生维生素，这样既能减轻还原糖对纤维素酶活性的抑制，又能进一步提高活菌饲料的性能。本研究以纤维素酶酶活、蛋白酶酶活、活菌数为考察指标，以成本廉价、来源丰富的玉米皮为主要原料，对黑曲霉与酿酒酵母混合体系的固态培养条件进行优化。

1　材料与方法

1.1试验材料菌种：黑曲霉DL-1，由大连工业大学提供；酿酒酵母，筛选自安琪高活性干酵母粉。玉米皮，由长春博纳士环保科技有限公司提供。

黑曲霉活化培养基（沙氏培养基）：葡萄糖4％，蛋白胨1％，115℃灭菌20min。

黑曲霉种子培养基（L）：玉米皮60 g，麸皮20 g，玉米浆干粉20 g，水900mL，121℃灭菌20min。

酵母菌培养基：去皮马铃薯200 g，切成小块，加水煮沸30 min，用纱布过滤后加入20 g葡萄糖，加水补至1 L，115℃，20min灭菌。

1.2试验方法分别考察尿素添加量、含水量、麸皮添加量、培养周期、接种量等因素对黑曲霉纤维素酶产量和活菌数的影响。在此基础上，选定麸皮添加量、培养周期、接种量设计三因素三水平的正交试验。在优化的黑曲霉固态培养条件基础上接入酵母菌，考察混菌接种比例、培养天数等因素对纤维素酶酶活、蛋白酶酶活及活菌数的影响。

1.3分析方法活菌数的确定：固态培养完成后，取0.5 g固态培养基置于10 mL离心管中，加入4.5mL的生理盐水，充分振荡混匀，释放出菌体，通过稀释涂布，计算出每克固态培养基所含的活菌数。

纤维素酶酶活的测定：取1mL稀释后的酶液于25mL的试管中，再加入1mL pH 4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，将试管置于40℃的恒温水浴锅中保温2 min，向每个试管中加入1 cm×1 cm的新华1号滤纸6片，准确计时60 min，然后置于沸水浴锅中10 min，使酶变性失活，冷却后，再向每个试管中加入3mL的DNS溶液，置于沸水浴锅中15 min，迅速冷却后，加入10 mL蒸馏水，混匀，在540 nm的波长下测吸光值，并从葡萄糖标准曲线中查找出相应的葡萄糖质量浓度，折算出酶活（胡慧东和许赣荣，2011）。纤维素酶酶活的定义：在pH 4.5、温度40℃条件下，每分钟分解滤纸产生1μg葡萄糖所需要的酶量定义为1单位酶活，单位为U/g（样品）或U/mL。

蛋白酶酶活的测定：取稀释后的酶液1 mL置于5mL的离心管中，与10 g/L的酪素溶液共同在40℃条件下预热5min，然后取1mL 10 g/L的酪素溶液迅速加入到离心管中，精确保温10min使酶发挥水解作用，10min后，迅速精确地向离心管中加入2mL 0.4 mol/L三氯乙酸，终止酶解反应，继续在水浴锅中保温20 min，使蛋白质变性沉淀，5000 r/min条件下离心10min，取上清液1mL于离心管中，加入福林酚试剂甲5mL，充分混匀后，置于25℃条件下保温10min，然后加入福林酚试剂乙0.5mL，立即摇匀，继续保温30min，500 nm波长下测吸光值，并从酪氨酸标准曲线中查找出相应的酪氨酸质量浓度，折算出酶活。蛋白酶酶活的定义：在40℃条件下，每分钟水解酪素产生1μg酪氨酸所需的酶量定义为一个单位的酶活，单位为U/g（样品）或U/mL。

测定所用福林-酚试剂甲、乙的区别如下，试剂A：称取1 g的碳酸钠置于烧杯中，配制0.2mol/L的氢氧化钠溶液，量取50 mL倒入烧杯，与碳酸钠混匀。

试剂B：配制1％的酒石酸钾钠，称取0.5 g的硫酸铜溶于100mL 1％的酒石酸钾钠溶液中，混匀。

将试剂A和试剂B按50∶1的比例混匀，即为试剂甲，该试剂现用现配。

试剂乙为生物公司购买的福林-酚试剂。

1.4数据统计方法应用Excel软件对数据进行统计分析，P＜0.05为统计学有显著差异。

2　结果与讨论

2.1黑曲霉固态培养条件的单因素考察鉴于黑曲霉具有能够产生丰富的纤维素酶、蛋白酶的特性，前期主要采用单因素试验考察麸皮添加量、含水量、尿素、培养周期、接种量等因素对黑曲霉产酶及活菌数的影响。

2.1.1尿素添加量的影响由图1可知，当尿素添加量为0.5％时，纤维素酶酶活最高，达到670.21 U/g，较对照组提高12.79％（P＜0.05）；活菌数也达到最高，是空白对照的1.61倍。由此可见，少量的尿素能够促进纤维素酶的合成，促进黑曲霉菌体的生长；而当尿素的含量过高，就会抑制纤维素酶的产生，导致酶活降低，这可能是由于尿素的添加量过高，影响了培养基的pH，不利于纤维素酶的产生。

图1　尿素添加量对酶活及活菌数的影响

2.1.2含水量的影响在黑曲霉固态培养过程中，水分的含量影响营养物质的运输和吸收，因此对黑曲霉的生长和产酶起着至关重要的作用。在固定玉米皮、麸皮和玉米浆干粉的比例为3∶1∶1的条件下，分别加入不同量的水，培养6 d后，测定酶活和活菌数，结果如图2所示。从图2可以看出，培养基含水量为60％时，酶活和菌落数达到最大值，这与已报道的研究结果类似（孙付保等，2010；王菁莎等，2006）。含水量太低，不利于黑曲霉对营养成分的利用，导致酶活及菌落数都较低，但水分含量过高，培养基的通透性变差，氧气供应不足，使菌体处于不利于生长的状态，导致酶活和活菌数也降低。

图2　含水量对酶活及活菌数的影响

2.1.3麸皮添加量的影响纤维素酶是一种诱导酶，本试验对麸皮的添加量对纤维素酶的诱导作用进行了考察。以玉米皮为主要培养基，玉米皮和玉米浆干粉比例为3∶1，含水量60％，不同麸皮添加量的培养结果见图3。从图3可以看出，当麸皮添加量为15％时，纤维素酶酶活达到最高，较对照提高34.59％（P＜0.05），黑曲霉的菌落数与麸皮添加量呈正相关。虽然麸皮的营养成分丰富，能够有效的诱导纤维素酶的产生，但如果含量过高，会导致灭菌后的培养基变黏稠，氧气供应不足，进而抑制酶的产生。菌落数与麸皮添加量正相关是因为产生了更多的孢子。

图3　麸皮添加量对酶活和活菌数的影响

2.1.4培养周期的影响以玉米皮为主要培养基成分，含水量60％，121℃、20min灭菌，接种量10％，考察不同培养时间对酶活及活菌数的影响，结果如图4所示。由图4可见，培养至第3天，培养基中开始出现明显的白色菌丝；第5天时，开始出现褐色的孢子。蛋白酶酶活与活菌数并未呈现正相关，第5天时达到了最大酶活（496 U/g）；纤维素酶酶活与菌落数呈正相关。活菌数随着培养周期的延长而增加，这是因为第5天之后有大量的孢子产生。

图4　培养时间对酶活和活菌数的影响

2.1.5接种量的影响接种量直接影响微生物培养的时间和质量，接种量过低，培养过程缓慢，培养时间延长；接种量过高，营养不足，导致菌体大量死亡，反而不利于最终的培养。不同接种量对玉米皮固态培养的影响结果如图5所示。由图5可见，不同试验组之间蛋白酶酶活的差异不显著，纤维素酶和活菌数都表现出了先增加后降低的趋势，接种量在15％时，纤维素酶酶活达到最大值，为511.82U/g。

图5　接种量对酶活和活菌数的影响

2.2正交试验优化固态培养工艺在单因素试验的基础上，确定玉米皮和玉米浆干粉的比例为3∶1，含水量为60％，再选定麸皮添加量、培养天数、接种量三个重要因素设计正交试验，如表1所示。正交试验结果如表2所示。从纤维素酶酶活角度考虑，最优组合为A2B3C2；蛋白酶酶活则为A1B1C2；活菌数的最优组合为A1B3C1。由此可见，孢子的产生不利于蛋白酶的形成，与单因素试验相吻合。综合考虑最优组合为A2B3C2，即麸皮添加量为15％，培养天数为7 d，接种量为20％。

2.3酿酒酵母接种时间对混菌培养的影响黑曲霉在培养过程中会产生多种酶类，将原料中的纤维素、半纤维素等水解成还原糖供自身生长利用。由于酶活较高，培养结束后会有过量的还原糖存在。为了降低还原糖对酶的抑制作用，同时增加饲料的性能，在培养过程中添加了酵母菌。本次试验考察了酵母菌接种时间对混菌共培养的影响。分别在黑曲霉培养第3、4、5天时接入酵母菌，培养结果如图6所示。由图6可见，纤维素酶和蛋白酶的酶活都表现出先增后降的趋势，最佳接种时间为第5天；就活菌数而言，共培养时间越长，活菌数越多。综合考虑，确定酵母菌的最佳接种时间为黑曲霉培养5 d后接种，即共同培养1 d。

图6　混菌共培养时间对酶活和活菌数的影响

表1　正交试验设计

表2　正交试验结果

2.4黑曲霉与酿酒酵母接种比对固态混菌培养的影响酵母菌生长所需的碳源依赖于黑曲霉，但同时又与黑曲霉竞争营养物质，阻碍黑曲霉的生长，抑制酶的生成。本试验不同比例接种量的培养结果如图7所示。从图7可以看出，添加少量的酵母菌对纤维素酶的产生是有利的，这与已报道的研究结果类似（唐海翠等，2006）。图中显示的最佳比例为4∶1；就蛋白酶酶活而言，最适混菌比例为3∶1，酶活较对照提高42.79％（P＜0.05）；而对活菌数而言，二者比例为3∶1时比较合适。酵母菌添加量过高，对纤维素酶、蛋白酶和活菌数均不利，这表明酵母菌与黑曲霉之间确实存在生长竞争关系。综合考虑，选定黑曲霉与酵母菌的最优接种比例为3∶1。