生产虾青素的雨生红球藻藻株及其培养基筛选

吴晓娟，唐小平，苏艳秋，罗国强（通威股份有限公司，四川成都610041）

生产虾青素的雨生红球藻藻株及其培养基筛选

吴晓娟，唐小平，苏艳秋，罗国强
（通威股份有限公司，四川成都610041）

为筛选获得适合大规模生产虾青素的藻株及适宜其生长和虾青素积累的培养基，研究比较了3个不同品系的雨生红球藻H 2、H 3、H 4在4种不同培养基BBM、BBM+1 g/L NaAC、SM、BG11中的生长和虾青素积累情况。结果表明：SM有利于雨生红球藻的生长和生物量的积累；而在相同培养基中，生长速度为H3＞H2＞H4。在所有试验组中，藻株H3在培养基SM中营养生长和生物量积累最快，在培养基BBM+1 g/LNaAC中虾青素含量（2.17％）和虾青素产量（30.1mg/L）最高，分别为其他试验组的1.16～4.72倍（P＜0.05）和1.18～6.28倍（P＜0.01）。因此，藻株H3比较适宜作为大规模培养的藻株，其最适生长繁殖和虾青素积累的培养基分别为SM和BBM+1 g/LNaAC。

雨生红球藻；培养基；干重；虾青素；筛选

［Abstract］Ⅰn order to gain the suitable algae and culturemedium for astaxanthin production，the influence of culture medium on the cell growth and astaxanthin accumulation of Haematococcus pluvialis were studied and compared.Three strains of Haematacoccus pluvialis（H2，H3 and H4）were cultured in four differentmedia（BBM，BBM+1 g/L NaAC，SM and BG11）.The results showed that the SM medium was benefit for the growth and biomass accumulation of Haematacoc鄄cus pluvialis.Ⅰn the samemedium，the growth rate was faster in H3 than H2 and H4.Ⅰn all experimental groups，the strain H3 had the fastest growth rate and biomass accumulation rate in themedium SM，and had the highest astaxanthin content （2.17％）and astaxanthin yield（30.1mg/L）in BBM+1 g/L NaACmedium，reaching 1.16～4.72 times（P＜0.05）and 1.18～6.28 times（P＜0.01）of those of other experimental groups，respectively.So，the strain H3 was fit for large scale cultivation，and its optimalmedium for growth and astaxanthin accumulation were SM and BBM+1 g/L NaAC，respectively.

［Key words］Haematacoccus pluvialis；culturemedia；dry weight；astaxanthin；selection

雨生红球藻是一种淡水单细胞绿藻，其细胞内的虾青素含量高达4％，是已知的天然虾青素含量最高的生物，被认为是自然界中生产天然虾青素的最好来源（Orosa等，2005）。虾青素是一种具有很强抗氧化性的类胡萝卜素，具有促进抗体产生、增强免疫力、抑制肿瘤、清除自由基和活性氧以及抗紫外线辐射等多种生物功能 （Martin和Mark，2003）。雨生红球藻中的虾青素在结构、生理功能（稳定性和氧化活性）、应用效果及安全性等方面要优于合成虾青素（蔡明刚等，2003）。大量研究表明，富含虾青素的雨生红球藻作为饲料添加剂，对鱼、虾等养殖对象的着色、存活率、生长、繁殖和发育、生理功能和营养价值具有积极的意义（吴晓娟等，2015；Ju等，2012；Ansari等，2011）。

然而目前雨生红球藻培养依然存在生长慢、生物量低、虾青素含量偏低等问题。雨生红球藻在弱光、氮磷丰富等适宜条件下进行营养生长积累生物量，在强光等不利条件下积累虾青素。其中，藻株和培养基质是雨生红球藻生长和虾青素积累的关键因子（董庆霖等，2007；刘健晖和李爱芬，2006）。本试验以3株不同品系的雨生红球藻为试验材料，研究4种不同培养基对雨生红球藻生长及虾青素积累的影响，以期筛选出适合大规模生产虾青素的藻株及其培养基，为大规模生产奠定基础。

1　材料与方法

1.1试验材料试验藻种为雨生红球藻（Haema鄄tococcus pluvialis）H2、H3、H4，购买自中科院水生生物研究所淡水藻种库，为经过本公司无菌纯化的藻种。

1.2试验方法将3株雨生红球藻预培养至对数生长期，分别接种于培养基BBM、BBM+1g/L NaAC、SM、BG11中，调整接种密度2×104/mL左右，每个试验组3个重复，置于光照培养箱中静置培养。营养培养8 d：25℃，光强3000 lx，24 h光照；诱导培养30 d：温度30℃，光强12000 lx，12 h光照。每天摇动培养瓶3～4次。

1.3生长指标测定

1.3.1藻细胞数及比生长速率的测定营养培养阶段每天定时取样，样品经lugol’s碘液固定后，利用血球计数板计数活细胞数。根据Gao等（2007）的方法，按以下公式，以藻细胞数来计算比生长速率（滋）：

式中：C1和C2分别代表培养时间为T1和T2时的藻细胞数。

1.3.2藻液OD值的测定参照刘健晖和李爱芬（2006）的方法，用分光光度计定时测定雨生红球藻营养细胞悬液在680 nm处的吸光度值（OD680），得到藻细胞的浓度，作为生物量的参考指标。

1.3.3细胞干重的测定通过把一定量的藻液过滤到已知干重的滤膜上，用蒸馏水冲洗掉藻细胞上附着的盐分，放入烘箱中经80℃烘干24 h以上至恒重，放在干燥器中冷却，经电子天平称重并减掉滤纸重量后得到藻体干重。（吴晓娟等，2013）

1.4虾青素测定方法根据Boussiba等（1992）的方法提取和测定虾青素。称取藻粉W mg，置于15mL玻璃试管中，加入4mL含5％NaOH、30％甲醇的水溶液，70℃水浴10min，保温过程中经常摇动，3000 r/min离心3min，弃去上清液（叶绿素被抽提到上清液中）。加入4mL含少量醋酸（5滴每10mL）的DMSO，摇匀，70℃水浴10min，间隔摇动玻璃试管。3000 r/min离心3min，将上清液转入25 mL容量瓶中。重复提取直到藻渣无色。将待测溶液放入1 cm光径比色皿中，用DMSO作为空白对照，在492 nm下测定吸光值A，按消光系数A1cm1％=2200及以下公式计算虾青素浓度：

式中：C1为溶液中虾青素的浓度；C2为藻粉中虾青素的含量。

1.5数据分析试验数据利用Excel 2007进行统计，结果以“平均值±标准差”表示，用Origin 7.0中的单因素方差分析方法（one-way ANOVA）对所得数据进行分析，P＜0.05和P＜0.01分别表示差异显著和差异极显著。

2　结果与分析

2.1培养基对雨生红球藻营养生长的影响图1可知，培养前2 d，雨生红球藻H2、H3在各培养基中OD680值没有明显差异，都处于生长延滞期，而雨生红球藻H4在培养基SM、BBM+1 g/L NaAc中生长表现出明显的优势。随培养时间的延长，3株雨生红球藻均在SM培养基中生长最快。培养到第8天，以培养基SM培养的H3营养生长最快，其OD680值达到0.85，为其他试验组的1.77～8.89倍（P＜0.01）。

由图1～2可知，培养8 d后，3株雨生红球藻在各培养基中细胞数与OD680值呈现相同的趋势。在所有3株雨生红球藻和4种培养基中，以培养基SM培养的H3营养生长最快，其藻细胞数为5.2×105个/mL，是其他组的1.71～4.53倍 （P＜0.01）。以培养8 d后的藻细胞数为基数，计算雨生红球藻营养生长阶段的比生长速率，结果见图3。由图3可知，4种培养基中，雨生红球藻H2在培养基SM中营养生长的比生长速率最快，分别比BBM、BBM （+NaAC）、BG11试验组高55.2％（P＜0.01）、18.6％（P＜0.01）、11.4％（P＜0.05）；H3也是在培养基SM中营养生长的比生长速率最快，分别比BBM、BBM （+NaAC）、BG11试验组高25.7％、32.1％、68.6％（P＜0.01）；H4是在培养基BBM （+NaAC）和SM中营养生长的比生长速率最快，比BBM、BG11试验组高24.4％～28.9％（P＜0.01）。

由上述分析来看，根据生长参数OD680、藻细胞数、比生长速率等指标判断，3株雨生红球藻（H2、H3、H4）均在培养基SM中营养生长最快；而在相同培养基中，生长速度为H3＞H2＞H4。在所有试验中，以培养基SM培养的雨生红球藻H3营养生长最快。

图1　3株雨生红球藻在不同培养基中营养生长阶段的OD680值变化

图2　不同培养基中雨生红球藻各营养生长阶段的细胞数

2.2培养基对雨生红球藻细胞干重的影响从图4可以看出，雨生红球藻H2、H3在培养基SM中的干重积累最高，而H4则在培养基BBM+1 g/L NaAc中的干重积累最高。相同培养基中，H2、H3的细胞干重均要高于H4。在各试验组中，以培养基SM培养的雨生红球藻H2、H3的藻细胞干重最高，达到1.72～1.75 g/L，比其他组高9.8％～79.8％ （P＜0.05）。因此，培养基SM有利于雨生红球藻的生长和生物量的积累。

图4　不同培养基中3株雨生红球藻的细胞干重

2.3培养基对雨生红球藻虾青素积累的影响由图5和图6可见，胁迫培养后，3株雨生红球藻（H2、H3、H4）在培养基SM中都没有变红，其虾青素含量均明显低于使用其他培养基的试验组，分别为其他培养基试验组的36.8％～52.7％、24.4％～28.2％、25.3％～42.0％（P＜0.01），不利于虾青素的积累。在所有试验组中，藻株H3在培养基BBM+ 1 g/LNaAC中的虾青素含量最高，达到2.17％，为其他组的1.16～4.72倍（P＜0.05）。

图5　不同培养基中3株雨生红球藻的虾青素含量

图6　不同培养基中3株雨生红球藻的虾青素产量

3株雨生红球藻在BBM+1g/LNaAC培养基中的虾青素含量和虾青素产量均高于BBM培养基（P＜0.05），可见乙酸钠可以促进雨生红球藻的虾青素合成和积累。在所有试验组中，采用培养基BBM+1g/L NaAC培养的H3和利用BG11培养的H2的最终虾青素产量均较高，且无显著差异，分别为30.1mg/L和29.4mg/L，为其他实验组的1.18～6.28倍 （P＜0.01）；但H3在培养基BBM+1 g/L NaAC中的虾青素含量更高，有助于降低虾青素提取成本。因此，在3株雨生红球藻中，藻株H3和培养基BBM+1 g/LNaAC比较适宜作为大规模培养的藻株和积累虾青素的培养基。

3　讨论

3.1培养基对雨生红球藻生长的影响在不同的培养基中培养，雨生红球藻的生长有较大的差异，可能与培养基的营养盐组分有关。本试验中，各培养基在C、N源种类及含量上存在较大差异。3株雨生红球藻均在SM培养基中营养生长最快，可能是由于SM培养基中主要C源为2.0 g/L乙酸钠，高于BBM+1 g/L NaAC试验组的乙酸钠含量，而培养基BBM、BG-11中无乙酸钠。董庆霖等（2007）认为乙酸钠大幅度提高了雨生红球藻细胞内硝酸还原酶的活性，使藻细胞迅速吸收硝酸盐进行异养生长，生物量迅速提高。此外，SM培养基中氮源为NH4NO3，其他3种培养基的N源均为NO3-。应巧兰和叶勇（2002）对不同氮源需求做了比较，表明雨生红球藻797在NH4+-N培养基中培养的生长速率明显高于 NO3--N培养基。Harker等（1995）也认为，与NO3--N相比，NH4+-N能被雨生红球藻优先利用。

3.2培养基对雨生红球藻虾青素积累的影响3株雨生红球藻在培养基SM中的虾青素含量和虾青素产量均明显低于使用其他培养基的试验组，可能是由于SM中的NH4+-N虽然有利于雨生红球藻生物量的积累，但不利于虾青素的积累。Harker等（1995）研究结果显示NH4+对藻细胞内虾青素的合成有抑制作用。

3株雨生红球藻在培养基BBM+1 g/L NaAC中的虾青素积累效果均优于其他培养基，可能是由于醋酸钠可以促进雨生红球藻的虾青素合成和积累，并且没有受到NH4+-N的抑制。Droop（1961）认为醋酸盐易被红球藻吸收参与虾青素的合成。董庆霖等（2007）研究了醋酸钠诱导雨生红球藻合成虾青素的机理，认为乙酸钠使雨生红球藻生物量提高，导致硝酸盐浓度的急速下降和氮源供应不足，进而造成了“碳饥饿”，使细胞内虾青素合成的相关基因被激活。

4　结论

4.1BBM、BBM+1 g/L NaAC、SM、BG11四种培养基中，3株雨生红球藻（H2、H3、H4）均在SM中营养生长最快；而在相同培养基中，生长速度为H3＞H2＞H4。

4.2在各试验组中，雨生红球藻H3在培养基SM中营养生长和生物量积累最快，在BBM+1 g/L NaAC培养基中虾青素含量和虾青素产量最高。4.3在3株雨生红球藻中，藻株H3比较适宜作为大规模培养的藻株，其最适生长和产虾青素的培养基分别为SM和BBM+1 g/LNaAC。

［1］蔡明刚，王杉霖，李文权，等.天然虾青素在水产养殖业中的应用研究进展［J］.台湾海峡，2003，22（3）：377～385.

［2］董庆霖，赵学明，邢向英.乙酸钠诱导雨生红球藻合成虾青素的机理［J］.微生物学通报，2007，34（2）：256～260.

［3］刘健晖，李爱芬.雨生红球藻在不同培养基的生长比较［J］.生态科学，2006，25（2）：113～115.

［4］吴晓娟，刘海燕，顾继锐，等.雨生红球藻在水产养殖中的应用［J］.中国饲料，2015，19：27～29.

［5］吴晓娟，钟华，刘海燕，等.螺旋藻优良藻株的选育［J］.食品与发酵工业，2013，9（7）：104～108.

［6］应巧兰，叶勇.影响雨生红球藻797株生长和虾青素积累的某些因素［J］.应用与环境生物学报，2002，8（1）：56～60.

［7］Ansari R，Alizadeh M，Shamsai M，et al.The effect of algal and synthetic astaxanthin（Haematococcus pluvialis）on egg quality of rainbow trout broodstock（Oncorhynchusmykiss）［J］.W orld JFish M ar Sci，2011，3（6）：539～547.

［8］Boussiba S，Fan L，Vonshar A.Enhancement and determ ination of astaxanthin accumulation in green alga Haematococcus pluvialis［J］.Method Enzymol，1992，213：386～391.

［9］Droop M R.Haematococcus plivialis and its alliesⅢ：oraganic nutrition［J］. Rev Algo N S，1961，4：247～259.

［10］Harker M，TsavalosA J，Young A J.Use of response surfaceme thodology to optim ize carotenogenesis in them icroalga Haematococcus pluvialis［J］.JAppl Phycol，1995，7：399～406

［11］Ju Z Y，Deng D F，Dom iny W.A defatted m icroalgae（Haematococcus pluvialis）meal as a protein ingredient to partially replace fishmeal in diets of Pacific white shrimp（Litopenaeus vannamei，Boone，1931）［J］.Aquaculture，2012，354-355：50～55.

［12］Gao K S，Guan W C，Helbling W E.Effects of solar ultraviolet radiation on photosynthesisof themarine red tide alga Heterosigma akashiwo（Raphidophyceae）［J］.JPhotoch Photobio B，2007，86：140～148.

［13］Martin G，M ark E.Haematococcus astaxanthin：applications for human health and nutrition［J］.TrendsBiotechnol，2003，21（5）：210～216.

［14］O rosa M，Franqueira D，Cid A，et al.Analysis and enhancement of astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis［J］.Bioresource Technol，2005，96（3）：373～378.

S963

A

1004-3314（2016）08-0029-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160808

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