产酸性木聚糖酶链霉菌的鉴定、酶学特性及发酵工艺研究

周　宁，王智伟，曹平华，2，王　磊，3，陈玉林，杨雨鑫*（.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌7200；2.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳47003；3.青海大学青海省畜牧兽医科学院，青海西宁80003）

产酸性木聚糖酶链霉菌的鉴定、酶学特性及发酵工艺研究

周宁1，王智伟1，曹平华1，2，王磊1，3，陈玉林1，杨雨鑫1*
（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100；2.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471003；3.青海大学青海省畜牧兽医科学院，青海西宁810003）

木聚糖是谷物类饲料中的主要抗营养因子。为筛选高效降解半纤维素的菌株，提高粗饲料利用率，本试验采用水解圈法从土壤中筛选出1株产木聚糖酶的细菌，经鉴定为灰略红链霉菌，命名为Streptomyces griseorubens W L003。该菌所产木聚糖酶的最适酶促反应温度和pH分别为65℃、4.5，于30～55℃处理10m in后，残余酶活不低于80％；于pH 3.5～11.0处理1.5 h，残余酶活仍保持在88％以上；Tween-80可提高木聚糖酶活力，而Cu2+、SDS 及β-巯基乙醇则会较强地抑制酶活。该菌株以9％接种量接种至最适发酵培养基，碳源为10％麦秸，氮源为1.41％牛肉膏，0.1％吐温-80，初始pH为6.0，经32℃、180 r/m in下培养7 d时，所产木聚糖酶活性最高，可达50.82 U/m L，为优化前2.5倍。菌株W L003对麦秸的粗纤维降解效果最好，对苜蓿草粉的粗纤维降解效果最差。证明从土样分离到的酸性木聚糖酶菌株W L003，在降解饲料粗纤维方面具有较好的应用潜力。

链霉菌；木聚糖酶；酶学性质；产酶条件优化

［Abstract］The cereal diet enriches in xylan，which is an non-starch polysaccharides as anti-nutrients for animals. The aim of this research was to isolate hemicellulose-decomposing strains with high enzyme activity.A new xylanase producing strain was selected，which was identified as Streptomyces griseorubens，named Streptomyces griseorubens WL003. The xylanase produced by Streptomyces griseorubens WL003 showed optimal activitywas at 65℃and pH 4.5.The residual xylanase activity was over 80％after treatmentat30～55℃for 10min.The residual xylanase activity was over 88％after treatment at pH 3.5～11.0 for 1.5 h，which showed the xylanase had good pH stability.Tween-80 could promote the enzyme activity，while Cu2+，SDS andβ-mercaptoethanol significantly inhibited the activity.The best liquid fermentation conditions for xylanase production showed as follow：fermentation time 7 d，inoculum dose 9％，initial pH 6.0，fermentation temperature 32℃，tween-80 0.1％，wheat straw 10％，nitrogen source 1.41％，shaking speed 180 r/min，the average activity of xylanase reached to 50.82 U/mL，and it was 2.5-fold of that before the optimization.The best effect of the crude fiber degradation was observed in wheat straw，however，the lowest effect of the degradation of crude fiber was found in alfalfa meal.Xylan-decomposing strain WL003 separated from soil sample could produce acid-stable xylanase and behave better development potential on crude fiber degradation.

［Key words］Streptomyces；xylanase；enzymatic characteristics；enzyme producing conditions

木聚糖酶可以将β-D-1，4-木糖苷键连接的木聚糖降解为低聚木糖。自然界中多种生物可以分泌木聚糖酶，如真菌、酵母、瘤胃细菌以及无脊椎动物等，部分植物也能产木聚糖酶。目前研究较多的是微生物法生产木聚糖酶（王丽和陈卫平，2005）。微生物木聚糖酶多为诱导酶，而木聚糖、木寡糖、木质纤维素残基是其常见的诱导底物（李秀婷等，2008）。已报道的从农业废弃物中分离筛选出的产木聚糖酶的菌株主要有木霉（Tenkanen等，2013；Miyauchi等，2013）、曲霉 （Fadel等，2014）、链霉菌（He等，2014）和芽孢杆菌（Kumar等，2014）等。吕秋凤等（2013）在小麦日粮中添加木聚糖酶，可减少14～42日龄AA肉仔鸡的肠道大肠杆菌数，降低食糜pH值和食糜黏度。王利等（2012）在以小麦作为基础的生长仔猪日粮中添加木聚糖酶，可以显著提高仔猪的生长性能和营养物质消化率（P＜0.05），维持肠道微生物菌群的平衡。通常微生物分泌的木聚糖酶的热稳定性和酸碱稳定性较差，这极大限制了其在饲料生产中的应用。因此，筛选稳定性好、耐酸、酶活高的木聚糖降解菌可有效提高粗饲料的利用，拓宽饲料资源。本研究从土样中分离产木聚糖酶的菌株，并对其进行种属鉴定，同时分析其所产木聚糖酶的酶学特性，优化发酵工艺条件，研究其所产木聚糖酶对三种粗饲料（麦秸、玉米秸秆、苜蓿草粉）的降解效果，进而为该酶作为酶制剂应用于粗纤维饲料降解提供依据。

1　材料与方法

1.1样品采集样品采集于咸阳市杨陵区长期堆积秸秆的土壤以及宁夏红寺堡区天源良种羊繁育养殖有限公司滩羊的粪便。

1.2培养基初筛固体培养基（g/L）：KH2PO41.0 g、MgSO40.3 g、NaCl 0.1 g、NaNO32.5 g、CaCl2·6H2O 0.1 g、FeCl30.01 g、桦木木聚糖20 g、琼脂20 g，pH 7.0，121℃灭菌30min。

桦木木聚糖分离培养基（g/L）：桦木木聚糖20 g、Na2HPO42.5 g、KH2PO41.5 g、蛋白胨2.5 g、琼脂20 g，pH自然，121℃灭菌30min。

基础产酶培养基（g/L）：蛋白胨10 g、酵母提取物 5 g、（NH4）2SO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41.0 g、NaCl 0.5 g、桦木木聚糖2.0 g、琼脂20 g，pH 7.0，121℃灭菌30min后备用。

发酵培养基：在100 mL基础产酶液体培养基（不添加木聚糖）中分别加入10.0 g小麦麸皮、麦秸、玉米秸秆、玉米芯，121℃灭菌30min。

科列亚科琼脂培养基（g/L）：KNO31 g、葡萄糖 20 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、柠檬酸铁0.5 g、CaCO31 g、琼脂20 g，121℃灭菌30min。

种子培养基（g/L）：土豆200 g/L、木糖20 g/L。将土豆去皮切块200 g，加蒸馏水煮沸30min，纱布过滤，将过滤后的土豆水用蒸馏水补足1 L，pH 7.0，121℃灭菌30min。

1.3菌株初筛、纯化及复筛取样品于50 mL灭菌离心管中，用灭菌蒸馏水进行不同梯度倍数（10-3、10-4、10-5、10-6）稀释。将不同稀释倍数的稀释液各100μL，均匀涂布于初筛培养基，每个稀释度三个重复，置于37℃恒温培养箱上，连续培养7 d后，加入适量1％的刚果红染液染色1 h，并用1 mo/L NaCl溶液进行脱色，观察菌落周边的水解圈直径与菌落直径比值（D/d）并测定其液体发酵粗酶液的酶活，将液体发酵酶活最高的菌株作为目的菌株，进行划线分离纯化。

将初筛纯化获得的单菌落接种于30 mL摇瓶（250mL）基础产酶培养基上，于37℃、220 r/min下培养适当时间后，取液体发酵液于10000 r/min、4℃离心10min，弃沉淀，上清液即为粗酶液。根据制定的木糖标准曲线和木聚糖酶活力测定方法测定该粗酶液的木聚糖酶活。

1.4木聚糖标准曲线的绘制及粗酶液木聚糖酶活力的测定采用DNS法测定木聚糖酶活力：取3支25 mL比色管，加入2 mL 1％桦木木聚糖，分别置于适温下预热2min，之后迅速加入0.1mL粗酶液，精准计时5 min后，立即加入2.5 mL DNS，煮沸5min后冷却，定容至10mL，混匀。对照组将粗酶液置于沸水中煮沸30min灭活，测定时取25 mL比色管，分别加入2 mL 1％桦木木聚糖，2.5 mL DNS和0.1 mL灭活粗酶液，混匀后煮沸5 min后冷却，定容至10 mL，混匀后用于空白对照，于540 nm波长比色。然后根据木糖标准曲线计算木聚糖酶活力。

酶活单位：按照以上方法测定木聚糖酶酶活，桦木木聚糖1 min内被分解成1μmol木糖所需要的酶量定义为1个酶活单位，U/mL。

分别吸取0.1％标准木糖溶液0、0.5、1.0、2.0、4.0mL，定容至10mL。取上述不同浓度木糖溶液各2mL于比色管中，每管分别加入3，5-二硝基水杨酸（DNS）2.5mL，煮沸5min。冷却后，加水稀释至10mL。用HⅠTACH紫外分光光度计U-3900 在540 nm波长下进行比色，以光密度值作横坐标，以标准木糖溶液浓度为纵坐标，绘制木糖标准曲线。

1.5菌株W L003的形态学鉴定及种属鉴定将筛选的目的菌株在科列亚科琼脂培养基上37℃恒温培养10 d，观察菌落的形态，并进行革兰氏染色。提取目的菌株的基因组DNA，以其基因组DNA为模板，利用16S rDNA通用引物，通过PCR扩增该菌株的保守片段，将扩增到的产物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，然后对测序结果进行同源性比对。

菌株的培养特征和部分生理生化特征按 《链霉菌鉴定手册》（1975）中的指导方法进行分析。

1.6菌株W L003木聚糖酶酶学性质分析将菌株的种子液接种于基础产酶培养基上，于37℃、220 r/min培养7 d，然后10000 r/min、4℃离心15 min制得木聚糖酶粗酶液。以下处理均设3个重复。

1.6.1最适酶促反应温度和酶的热稳定性将粗酶液与底物缓冲液混匀，利用DNS法分别于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃下测木聚糖酶活力。酶的热稳定性测定方法为将粗酶液在不同温度（30、35、40、45、50、55、60、65℃）下处理10min，利用DNS法于最适温度和pH测定木聚糖酶活力，以未经处理的粗酶液的酶活力的100％计算。

1.6.2最适酶促反应pH和酶的pH稳定性将不同pH值（3.0～12.0）的底物缓冲液与粗酶液混匀，利用DNS法于最适温度下测定木聚糖酶活力。酶的pH稳定性测定方法为将粗酶液与不同pH底物缓冲液混匀置于4℃恒温培养箱中放置1.5 h，利用DNS法于最适反应条件下测定木聚糖酶活力，以未经处理的粗酶液的酶活力为100％计算。

1.6.3对金属离子和有机试剂的耐受性将粗酶液与相应浓度的金属离子溶液和有机试剂溶液混匀，4℃处理1.5 h。利用DNS法在最适反应条件下测定木聚糖酶活力，以未经处理的粗酶液的酶活力为100％计算。

1.7菌株W L003产酶条件优化通过单因素试验，确定液体发酵时间、接种量、初始pH、碳源、氮源对菌株产木聚糖酶的影响。

通过正交试验优化菌株WL003的培养温度、吐温-80添加量、麦秸添加量、转速，每个因素3个水平（表1）。

表1　正交试验因素与水平

1.8菌株W L003产木聚糖酶对粗纤维的降解效果取2.0 g农业废弃物（麦秸、玉米秸、苜蓿草粉）与90 mL乙酸钠缓冲液（pH 4.5）混匀，于121℃高压灭菌30min，加入最佳产酶条件下制得的粗酶液10 mL（酶活单位为50.82 U/mL），以相同体积的基础产酶培养液作空白对照，于37℃恒温摇床中分别处理12、24、36、48、60 h，测定处理液中还原糖含量（取降解液2 mL与2.5 mL DNS混匀煮沸5min，测定OD540值），每个处理重复3次。

1.9数据分析用SPSS 19进行统计差异性分析，以P＜0.05作为检验各项数据的差异显著性水平。

2　结果与分析

2.1菌株的筛选与鉴定

2.1.1产木聚糖酶菌株的筛选经反复筛选，获得6株产木聚糖酶菌株。由表2可知，其中5株分离于滩羊粪便，1株分离自土壤（WL003）。由表2可知，菌株 WL003的木聚糖酶活性最高，为20.68 U/mL，因此选作后续研究对象。

表2　木聚糖酶产生菌筛选结果

2.1.2菌株形态学鉴定将菌株WL003接种科列亚科琼脂培养基上生长10 d后，可观察到菌落成圆形、灰白色、周围气生菌丝成发散状分布；刚果红染色发现菌体周围有明显的水解圈；显微镜下观察气生菌丝，发现菌丝呈柔曲状、紧密交错；革兰氏染色呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌。

2.1.3培养特征和生理生化特征菌株WL003在大多数培养基上生长良好，但是在葡萄糖天冬素培养基上无法生长。菌株气生菌丝在高氏合成1号呈灰白色，培养基内菌丝呈褐色；克式合成1号气生菌丝呈白色，培养基内菌丝呈污黄色，周围可产生微黄色色素；察氏琼脂培养基气生菌丝呈白色，培养基内菌丝呈乳脂色；淀粉琼脂培养基上气生菌丝呈白色，基内菌丝呈乳脂色；马铃薯块上气生菌丝呈白色，而培养基内菌丝呈浅褐色。

菌株WL003生理生化特征的分析结果表明该菌株牛奶凝固随后胨化，明胶液化、淀粉水解、纤维素生长产生的反应为阳性，硝酸盐还原、色素产生为阴性，不产生H2S。能利用木糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、甘油、酒石酸钾钠、柠檬酸钠，不能利用蔗糖。

2.1.4菌株WL003的16SrDNA序列分析以菌株WL003的基因组DNA为模板，用16S rDNA通用引物扩增该菌株16S rDNA基因，测序后，将测序结果进行 NCBⅠBlast同源性比对，发现WL003的16S rDNA与Streptomyces griseorubens strain MMH9（KR133201.1）相似性达99％。将比对到的同源性高的16S rDNA序列，利用MEGA5.10软件中Neighbor-Joining方法，bootstrap值设定为1000，构建系统发育树。结果见图1。结合菌株的培养特性和生理生化特性，参考 《链霉菌鉴定手册》，该菌株与灰略红链霉菌（Streptomyces grise鄄orubens）的特性比较相似，因此鉴定WL003为灰略红链霉菌。

图1　基于16S rDNA基因同源序列构建的菌株WL003系统发育树

2.2菌株WL003所产木聚糖酶的酶学性质分析

2.2.1酶促反应的最适pH和对pH稳定性如图2A和C所示，菌株WL003所产木聚糖酶在pH 4.5时的酶活性最高，在pH 3.5～11.0范围内仍有较高的活力。因此说明，该菌所产木聚糖酶具有较宽的pH范围，尤其是对偏酸性环境的适应性较强。粗酶液于pH 3.5～11.0处理1.5 h，残余酶活可保持在88％以上，说明该菌株具有较宽pH稳定范围。

注：A为最适pH，B为最适温度，C为pH稳定性，D为热稳定性。图2　菌株产木聚糖酶酶学性质分析

2.2.2酶促反应的最适温度和热稳定性图2B 和D显示，菌株WL003所产木聚糖酶的最适反应温度为65℃，粗酶液在30～55℃处理10min后，残余酶活可保持在80％以上；60℃处理10min后，残余酶活仅有36％，说明菌株WL003所产的木聚糖酶在60℃以下时耐热性较好。

2.2.3对金属离子及有机溶剂的耐受性由表3可知，Cu2+、SDS和β-巯基乙醇处理粗酶液后，木聚糖酶酶活分别下降至 34.84％、41.17％和47.95％，说明三者对木聚糖酶活力起较强的抑制作用。而Tween-80处理粗酶液后，其酶活提高至112.12％，说明吐温对木聚糖酶活力有一定的促进作用。

2.3链霉菌W L003的产酶条件优化

2.3.1不同接种量对菌株 WL003产酶的影响由图3可知，以9％的接种量发酵的粗酶液中木聚糖酶活力最高，为19.41 U/mL，但与5％、7％和11％接种量的酶活力差异不显著（P＞0.05），因此选择接种量为9％作为最佳接种量进行后续试验。

2.3.2不同培养时间对菌株WL003产酶的影响由图4可知，发酵3 d时，WL003所产木聚糖酶酶活较低，随着发酵时间的延长，酶活力也随之增加，第7天达到最大值，为32.00 U/mL，从第8天开始酶活力下降，蛋白质被分解，酶活下降。

表3　金属离子和有机试剂对木聚糖酶酶活的影响

注：大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）；下同。图3　不同接种量对菌体产酶的影响

图4　不同培养时间对菌株WL003产酶的影响

2.3.3不同初始pH对菌株WL003产酶的影响在优化产酶培养基的基础上，用1 mol/L的HCL 或1 mol/L的NaOH溶液调节初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）进行液态发酵7 d。结果见图5。由图5可知，初始pH为 6.0时，其发酵粗酶液的木聚糖酶活力最高，达33.04 U/mL。说明该菌株所产的木聚糖酶的最适pH是偏酸性的。

图5　不同初始pH对菌体产酶的影响

2.3.4不同碳源对菌株WL003产酶的影响由图6可知，以麦秸作为碳源培养7 d时，WL003所产木聚糖酶酶活最高，为33.64 U/mL，显著高于玉米芯、玉米杆和麸皮（P＜0.05）；而玉米芯作为碳源时，WL003所产木聚糖酶活性显著高于玉米杆和麸皮。因此选择麦秸作为碳源进行后续试验。

图6　不同碳源对菌体产酶的影响

2.3.5不同氮源对菌株WL003产酶的影响由图7可知，以牛肉膏（1.41％）作为氮源发酵的粗酶液中木聚糖酶活力最高，为34.31 U/mL，酵母提取物次之，氯化铵最低。因此选择牛肉膏作为发酵的最佳氮源。

图7　不同氮源对菌株WL003产酶的影响

2.3.6不同培养温度、转速、麦秸添加量、吐温-80添加量对WL003产酶的影响结果见图8。为提高菌株产酶能力，在之前培养基优化的基础上，应用正交试验进一步优化菌株WL003发酵产酶条件。结果表明，当菌株WL003产酶培养基吐温-80添加0.1％、麦秸添加10％，于32℃、180 r/min发酵培养7 d时，粗酶液木聚糖酶活力高达50.82 U/mL，最适发酵条件下菌株WL003所产木聚糖酶的酶活是优化前的2.5倍。

注：图中2、6、10为麦秸添加百分含量。图8　不同培养温度、不同转速、麦秸添加量、吐温-80添加量下菌株WL003产木聚糖酶活力的比较

2.4粗纤维降解效果分析将菌株WL003所产木聚糖酶粗酶液分别处理麦秸、玉米秸、苜蓿草粉。于不同时间测定三种粗饲料的还原糖含量。结果发现，三种粗饲料中还原糖含量随酶液处理时间显著变化（P＜0.05），其中麦秸和苜蓿草粉呈极显著变化（P＜0.01）。菌株WL003所产粗酶液对麦秸的降解效果最好，对苜蓿草粉的降解效果最差（表4）。

表4　不同处理时间三种粗纤维还原糖的含量

3　讨论

本试验利用此方法筛选得到一株降解木聚糖的菌株，对其生理生化特性、培养特性及16S rDNA序列进行分析，鉴定WL003为灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens）。产木聚糖酶菌株报道较多的是丝状真菌（包怡红等，2005）。链霉菌虽然是细菌，但在形态上分化有菌丝和孢子，培养特性与真菌类似，具有真菌的特性，在木聚糖酶产生过程中，用孢子进行接种，经液体培养利用菌丝产酶。

由于营养物质的消耗以及菌体代谢产物的增加，导致发酵环境较起始发生改变不利于产酶，液体发酵7 d酶活达到最高，随后开始下降，因此菌株WL003最佳发酵时间为7 d。不同接种量对酶活有一定的影响，接种量太小，接入的生物量不足，至产酶量上不去；接种量太大，菌体之间相互竞争营养物质及空间通气量，进而影响菌体的生长，无法大量分泌成熟的酶蛋白。以接种量9％种子液进行接种，产酶最佳；初始pH影响菌丝的生长，菌丝对酶活有直接的影响，结果表明初始pH 为6.0接种的粗酶液木聚糖酶活力最高。放线菌和细菌的最适生长和产酶pH接近于中性 （陆键和曹钰，2001），而本试验发现，偏酸性条件有利用菌株WL003木聚糖酶的产生。吐温-80是一种表面活性剂，由于表面活性剂可以增加细胞膜的通透性，减少酶在膜上的吸附率，有利于产物酶及时分泌到胞外（Battan等，2007）。添加吐温-80能够提高产酶活性，最佳添加量为0.1％。一般来说有机氮较于无机氮发酵分泌的木聚糖酶酶活更高（Zhang等，2013）。说明菌株偏好利用营养丰富的氮源进行生物体的代谢，本试验中以牛肉膏作为氮源，菌株WL003发酵液的酶活最高。由于木聚糖酶通常是一种诱导酶，在诱导物的诱导下，刺激菌体分泌较多的木聚糖酶蛋白到胞外，本试验发现，以麦秸作为诱导碳源，液态发酵产酶最高。农业废弃物作为诱导物能够有效地降低酶制剂的生产成本，实现木聚糖酶在饲料工业中的广泛应用。

本试验中链霉菌胞外分泌木聚糖酶最适反应温度和 pH分别为 65℃、4.5，这与冯佳丽等（2011）报道的结果相似。但WL003所产木聚糖酶的酶促反应温度较高，而且具有较好的热稳定性。WL003所产木聚糖酶的最适pH值为4.5，而已报道的放线菌最适生长和产酶pH大多接近于中性，表明菌株WL003可能分泌一组偏酸性木聚糖酶。酶在工业上的应用，一般要经过长时间的高温（50～60℃）处理，因此酶对高温耐受性成为评价其性质的重要指标。热处理后酶残余的酶活力通常预示在高温条件下酶蛋白的结构域与催化域的稳定性。本试验所产木聚糖酶在30～55℃处理10 min后，剩余酶活可保持在80％以上，说明试验菌株产木聚糖酶对热环境具有一定的耐受力，热稳定性较好。该酶在pH 3.5～11.0缓冲液中处理90 min，仍有88％以上的剩余酶活，说明该酶对pH值（pH 3.5～11.0）耐受范围较宽，具有更广泛的应用潜力。该酶对酸和碱耐受性较好，其应用于饲料工业进行工艺处理时具有很强的适应性和耐受度。金属离子及有机试剂的耐受性结果显示，Tween-80对木聚糖酶酶活有促进作用，Cu2+、SDS

和β-巯基乙醇处理对酶活有较强的抑制，因此将该酶应用于饲料加工时应尽量避免接触这些抑制剂。通过酶学性质分析，菌株WL003表现出较好的酶学性质，表明将其产木聚糖酶作为饲用酶制剂应用于饲料工业有很大的潜力和价值。

4　结论

本试验筛选得到一株木聚糖降解菌株WL003，经鉴定为灰略红链霉菌，命名为Strepto鄄myces griseorubens WL003。菌株WL003所产木聚糖酶最适温度为65℃，最适pH为4.5，具有较好的耐热性和pH稳定性；Tween-80可提高木聚糖酶活力，而Cu2+、SDS及β-巯基乙醇对酶活有较强的抑制作用。菌株WL003的最佳产酶条件为：接种量9％，碳源为10％麦秸，氮源为1.41％牛肉膏，0.1％吐温-80，初始pH为6.0，于32℃、180 r/min条件下培养7 d。该条件下所产木聚糖酶活性最高，为50.82 U/mL。菌株WL003对麦秸具有较强的降解能力。

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S816.7

A

1004-3314（2016）08-0016-06

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160805

国家自然基金（31072060）；国家绒毛用羊产业技术体系（CARS-40-13）