基质固相分散在蜜蜂与蜜蜂产品分析中的应用进展

涂熹娟　马双琴　高照生　陈文彬　吴珍红　缪晓青（福建农林大学蜂学学院，福建农林大学蜂疗研究所，蜂产品加工与应用教育部工程研究中心，福州350002）

基质固相分散在蜜蜂与蜜蜂产品分析中的应用进展

涂熹娟马双琴高照生陈文彬吴珍红缪晓青
（福建农林大学蜂学学院，福建农林大学蜂疗研究所，蜂产品加工与应用教育部工程研究中心，福州350002）

基质固相分散（Matrix solid phase dispersion，MSPD）是一种适用于固体，半固体样品的前处理方法。本文综述了MSPD方法开发至今在蜜蜂及蜜蜂产品中的应用，并对影响MSPD提取与净化效果的主要参数进行了归纳和总结。

基质固相分散；样品前处理；蜜蜂；蜂产品

蜜蜂及蜜蜂产品均为基质复杂的分析样品，样品中含量丰富的脂类，色素，有机酸，维生素，蛋白质，以及氨基酸等多种成分有可能对分离与检测带来干扰［1］。因此，开发适合的样品前处理方法以从复杂的样品基质中提取和净化目标物，是蜜蜂及蜜蜂产品分析的关键。本文将介绍适用于固体，半固体样品前处理的基质固相分散方法在蜜蜂以及蜜蜂产品分析中的应用进展。

1　基质固相分散

基质固相分散（Matrix solid phase dispersion，MSPD）是在固相萃取基础上发展起来的一种新的萃取、净化方法［2］，其基本操作流程是首先将样品直接与固相分散剂充分研磨而使样品均匀分散于固定相颗粒表面，接着将混匀形成的半固态作为特殊的色谱固定相装柱，最后选择合适的溶剂将待提取成分洗脱收集。

在MSPD中，固相分散剂同时起到了支持、吸附和净化的作用。分散剂可在与样品的研磨过程中提供剪切力以破坏样品的组织结构。样品被研磨成更小的部分并吸附在固相分散剂表面，起到增大萃取样品比表面积的作用，进而提高样品的提取率。MSPD尤其适用于固体，半固体或粘性样品的处理。将MSPD同经典的固相萃取方法相比，可以发现固相萃取只提供净化作用，在固相萃取处理之前仍需额外的提取操作；而MSPD则实现了提取和净化的一步完成，大大缩短了实验时间，也降低了样品在提取、转移等过程中的损失。

基质固相分散中影响提取和净化效果的主要因素包括：（1）吸附剂的选择。常用的吸附剂包括商品化的C18、C8、硅胶、Florisil、氧化铝、石墨化碳等；（2）吸附剂同样品的用量。常见方法中一般使用0.5 g样品，考察的分散剂与样品的比值处于1～4之间；（3）淋洗液和洗脱液的组成与体积。淋洗液用在洗脱之前以部分去除杂质干扰；通过优化洗脱液组成和体积，使目标物的提取率达到分析方法要求，并在此基础上降低溶剂的消耗量。（4）共净化柱。为了达到更好的净化效果，可以在MSPD柱的底部装填一小段的共净化柱。共净化柱中只含有吸附剂，用于辅助提高净化效果，可根据样品基质的特点而选择吸附材料。

下面将按照分析样品的种类介绍MSPD方法应用于蜜蜂及蜜蜂产品分析的进展，具体的方法参数总结于表1中。

2　蜜蜂样品分析

蜜蜂的采集行为对于农业生产至关重要，但也使其可能接触到环境中的化学污染物，特别是杀虫剂的接触可能是造成蜜蜂数量下降的原因之一［3］。此外，由于与环境之间的密切关系，蜜蜂也被当做一种生物指示器用于研究环境中化学污染物的暴露［4］。蜜蜂样品中化学污染物的残留量通常处于痕量范围，且蜜蜂个体中的蜂蜡、蛋白、色素等成分可能为分析带来样品基质的干扰，使得蜜蜂样品的前处理方法往往需要较为繁琐的提取与净化步骤，而MSPD方法的应用有助于蜜蜂样品前处理操作的简便化。

B.Morzycka首次报道采用基质固相分散的样品前处理方法用于蜜蜂中12种杀虫剂的检测［5］。对于蜜蜂中农药残留的检测，传统方法需要先从蜜蜂样品基质中提取出目标物，再对提取物进行净化。采用MSPD的方法则可以使提取和净化操作一步完成，简化样品前处理操作步骤以及节省样品前处理时间。方法中采用Florisil为分散剂，正己烷-乙酸乙酯的混合溶液作为洗脱液，在硅胶共净化柱的作用下完成杀虫剂的提取与净化。同传统的溶剂提取相比，MSPD的方法在低浓度条件下显示出了更好的净化效果，使得采用传统方法由于背景干扰而无法采用ECD检测器分析的甲基谷硫磷、毒死蜱、杀螟硫磷、乙硫磷、以及氟虫腈等农药，MSPD方法处理后可以获得较好的检测结果。此外，MSPD方法在样品制备时间，有机溶剂消耗等方面也有显著的提升。

M.Fernández等［6］报道了蜜蜂中22种有机磷农药的多残留分析方法，该方法采用C18为分散剂，二氯甲烷-甲醇混合溶液为洗脱液。文章中研究了不同洗脱液对目标有机磷农药的洗脱效果，结果显示正己烷作为洗脱液时回收率只有4%；采用二氯甲烷虽然共洗脱的基质较少，但回收率只处于40～60%之间；采用二氯甲烷-甲醇的混合溶液则可以提供适合的回收率，同时基质干扰也较少。方法中还考察了三种共净化吸附剂（硅胶，Florisil，氧化铝）的辅助净化效果，结果表明氧化铝对于目标有机磷农药的吸附作用较大而导致回收率显著低于硅胶和Florisil；在二氯甲烷-甲醇的洗脱条件下，Florisil对极性共提取物的去除效果要优于硅胶。

S.Totti等［7］报道了蜜蜂中吡虫啉、西维因、涕灭威及其代谢物的残留检测方法。该研究比较了C18，C8，石墨化碳等分散剂的提取效果，结果显示三种分散剂的提取率相近，但C18可获得更干净的色谱图。文章还比较了MSPD同传统液液萃取的提取效率，结果表明MSPD在方法回收率，灵敏度上均优于液液萃取；此外，MSPD同液液萃取相比还体现了快速（30 min相比于2 h），样品用量少（1 g相比于3 g），溶剂消耗量少（10 ml相比于230 ml）的优点。

B.Lozowicka［8］报道了基于MSPD的蜜蜂中153种农药的筛查方法。方法采用Florisil作为分散剂，C18作为共净化剂。Florisil用于除去极性的干扰组分，C18则有利于降低蜜蜂样品中脂类物质的干扰。

A.I.García-Valcárcel［9］报道了蜜蜂中10种环境污染物的检测方法。方法采用Florisil为分散剂，氧化铝为共净化剂，提取过程采用正己烷作为淋洗液去除脂类干扰物，之后采用乙腈作为洗脱液洗脱目标物。此外，提取过程采用超声辅助可以增大目标物的回收率。同QuEChERS方法相比，MSPD使用更少的样品量（0.5 g相比于5～10 g），消耗更少的溶剂（5 ml相比于10 ml）。

3　蜜蜂产品分析

3.1蜂蜜

蜂蜜是最主要的蜜蜂产品，也是蜜蜂产品分析中前处理技术的主要研究对象。蜂蜜中高的糖浓度，蜡质残留，植物来源的色素、有机酸、酚类化合物，以及蛋白质，氨基酸等多种不同性质的化学组成也使得基质的组成较为复杂［10］。J.L.Tadeo团队在MSPD应用于蜂蜜中农药残留检测做了系统的工作［11-13］。他们首先报道了采用Florisil和无水硫酸钠做为混合分散剂，对蜂蜜基质中的15种农药残留建立了MSPD的前处理方法［11］。无水硫酸钠可吸收蜂蜜中的水分，避免水分与低极性洗脱液之间形成两相而降低提取率。该方法还对经典的MSPD流程进行了改进，1 g的蜂蜜首先与1.5 ml甲醇混合后再与分散剂结合，并在超声辅助下使样品与分散剂充分作用以提高回收率。论文采用正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂作为洗脱液，蜂蜜中可能的干扰物例如蜡质和色素等吸附于分散剂Florisil中，得到的提取液无需再次的净化步骤即可采用GC-ECD进行分析。此后，该团队还采用相同的方法流程，进一步建立了针对14种农药的前处理方法［12］，以及16种多环芳烃类环境污染物的检测，通过与GC-MS检测技术的结合，对多环芳烃的检测限可以达到0.04～2.9 ppb［13］。此外，D.S.S.Bezerra等报道了以硅胶为吸附剂，乙腈为洗脱液，结合GC-MS建立蜂蜜中4种农药残留的检测方法［14］。作者对影响提取效率的吸附剂种类，洗脱液组成，洗脱体积等条件进行了研究，结果显示硅胶作为分散剂产生的基质干扰较少；丙酮做为洗脱液回收率较低，而正己烷-乙酸乙酯的混合洗脱液虽回收率较高但基质增强现象严重，乙腈则是综合结果较佳的洗脱液。国内的研究人员也报道了MSPD在蜂蜜分析中的应用，例如乔凤霞等［15］报道了以C18为吸附剂，乙腈为洗脱液，建立蜂蜜中4种氟喹诺酮类药物检测的MSPD前处理方法。周建科等［16］报道了蜂蜜中3种苯酚类污染物检测的MSPD处理方法，方法采用Florisil为分散剂，DMF为洗脱液，检测的灵敏度为50～60 ppb，方法对市售的蜂蜜样品进行了检测，结果均未检出。余辉菊等［17］采用C18为分散剂，二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶液洗脱，建立了蜂蜜中10种磺胺类药物的MSPD前处理方法。

表1　MSPD在蜜蜂及蜜蜂产品分析中的应用总结

3.2蜂胶

蜂胶由于其生物活性，在功能食品中具有良好的应用前景［18］。蜂胶样品基质的特点在于其多酚类化合物的含量高，低极性的蜂蜡等组分可能与农药残留共洗脱而干扰检测。T.F.S.Santos等［19］首次报道了MSPD的方法在蜂胶样品制备中的应用。他们系统研究了分散剂，洗脱液等对提取效果的影响，结果显示二氯甲烷洗脱得到的产物回收率较低；二氯甲烷和正己烷的混合溶剂，回收率有一定提高，但基质干扰同样增大；采用二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液可以使回收率和基质干扰获得较好的平衡。在此基础上，采用Florisil作为共净化剂，可以进一步的降低基质干扰。

A.Pérez-Parada等［20］报道了蜂胶酊剂中3种有机磷农药的检测方法，该方法采用无水硫酸铝作为分散剂，结合Florisil共净化实现样品的前处理。作者发现利用铝对黄酮类物质的络合作用，结合低极性的二氯甲烷或者乙酸乙酯洗脱液，可使蜂胶中含量较多的黄酮类物质保留在硫酸铝柱中，从而降低样品基质对目标农药的干扰。

表1　续MSPD在蜜蜂及蜜蜂产品分析中的应用总结

G.M.Acosta-Tejada等［21］报道了采用C18为吸附剂，乙酸乙酯为洗脱液，无需共净化柱辅助净化，实现对蜂胶中5种有机磷农药的检测。K.Medina-Dzul等［22］进一步研究了混合溶剂对这5种有机磷农药检测的影响。文中选择乙腈为固定组成进行混合溶剂的研究，之所以选择乙腈是由于其较强的极性可减少提取液中脂类杂质的共洗脱。选择低极性的溶剂与乙腈混合，可实现对低极性有机磷农药的提取。结果显示乙腈-正己烷的混合液表现出对蜡质的亲和作用，甲基异丁基酮和丙酮的体系则提取到较多的长链烷烃；乙酸乙酯与二氯甲烷体系的回收率可以满足要求，且基质干扰相对较少。K.Medina-Dzul等［23］最近报道了SiO2-聚乙烯基咪唑复合材料作为新型MSPD吸附剂，对蜂胶中5种有机磷农药的检测。论文中合成吸附剂和商品化C18吸附材料的提取效果相近。

3.3蜂花粉

蜂花粉营养丰富，具有多种健康促进功能［24，25］。蜂花粉中不饱和脂肪酸，萜类，黄酮类，维生素，蛋白质等不同化学性质的功能成分含量均较高，加大了其在分析检测时样品制备的难度。此外，花粉壁的稳定性也使提取操作可能需要附加的破壁步骤。MSPD方法中针对固体样品的剪切力，以及提取、净化一步完成的特点刚好可以较好的解决蜂花粉样品制备时面对的问题。

C.Sánchez-Brunete等［26］报道了MSPD在蜂花粉中氟虫腈检测的前处理应用。论文研究了Florisil、氧化铝以及C18三种分散剂的提取效果，结果显示Florisil得到的提取液干扰物最少；而采用正己烷或者乙酸乙酯作为洗脱液时提取物中脂类物质含量较多；使用乙腈可以获得较好的回收率，且可以进一步借助低温条件下脂类物质在乙腈中的低溶解度，使其沉淀而解决花粉基质中脂类物质的干扰问题。

C.Torres-Perea等［27］比较了Florisil与合成的TiO2-聚乙烯基咪唑和TiO2-聚苯乙烯分散剂对于蜂花粉中5种有机磷农药的回收率。研究结果显示对于二嗪磷和马拉硫磷，TiO2吸附材料的回收率和Florisil相近；Florisil对敌敌畏的回收效果要好于TiO2，而甲基对硫磷和蝇毒磷由于在TiO2的强吸附作用而无法检出。

P.E.Vazquez-Quintal等［28］采用C18为吸附剂，乙腈为洗脱液建立了针对蜂花粉中8种有机氯农药残留的样品制备方法。采用C18为吸附剂，乙腈为洗脱液可较好去除非极性组分的可能干扰。此外，PSA作为共净化剂可进一步降低极性组分的干扰从而降低背景信号。

4　结语

近年来，MSPD在蜜蜂与蜜蜂产品分析中的应用主要针对的是化学污染物残留。MSPD的方法特点与蜜蜂、蜜蜂产品固体，半固体的性质可以良好融合。MSPD近期出现的小型化［29］发展趋势可能可以进一步推进蜜蜂及蜜蜂产品中污染物残留检测技术的发展。此外，针对功能成分的提取与净化开始见诸报道［30］，蜂产品中高含量组分的分析可能也是今后应用的方向。

［2］Barker S A．Matrix solid phase dispersion（MSPD）［J］．J Biochem Biophys Methods，2007，70（2）：151-162.

［3］Johnson R M，Ellis M D，Mullin C A，et al．Pesticides and honey bee toxicity USA［J］．Apidologie，2010，41（3）：312-331.

［4］吴黎明，王勇，田晓薇，等．蜜蜂及其产品作为环境污染生物指示器的研究进展［J］．中国农业科技导报，2008，10（3）：18-23.

［5］Morzycka B．Simple method for the determination of trace levels of pesticides in honeybees using matrix solid-phase dispersion and gas chromatography［J］．J Chromatogr A，2002，982（2）：267-273.

［6］Fernández M，Picó Y，Maes J．Rapid screening of organophosphorus pesticides in honey and bees by liquid chromatographymass spectrometry［J］．Chromatographia，2002，56（9-10）：577-583.

［7］Totti S，Fernández M，Ghini S，et al．Application of matrix solid phase dispersion to the determination of imidacloprid，carbaryl，aldicarb，and their main metabolites in honeybees by liquid chromatography-mass spectrometry detection［J］．Talanta，2006，69（3）：724-729.

［8］Lozowicka B．The development，validation and application of a GC-dual detector（NPD-ECD）multi-pesticide residue method for monitoring bee poisoning incidents［J］．Ecotoxicol Environ Saf，2013，97：210-222.

［9］García-Valcárcel A I，Molero E，Tadeo J L，et al．Determination of selected contaminants in foraging honeybees［J］．Talanta，2016，148：1-6.

［10］Kujawski M W，Namienik J．Challenges in preparing honey samples for chromatographic determination of contaminants and trace residues［J］．Trends Anal Chem，2008，27（9）：785-793.

［11］Albero B，Sánchez-Brunete C，Tadeo J L．Multiresidue determination of pesticides in honey by matrix solid-phase dispersion and gas chromatography with electron-capture detection［J］．J AOAC Int，2001，84（4）：1165-1171.

［12］Sánchez-Brunete C，Albero B，Miguel E，et al．Determination of insecticides in honey by matrix solid-phase dispersion and gas chromatography with nitrogen-phosphorus detection and mass spectrometric confirmation［J］．J AOAC Int，2002，85（1）：128-133.

［13］Albero B，Sánchez-Brunete C，Tadeo J L．Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in honey by matrix solid-phase dispersion and gas chromatography/mass spectrometry［J］．J AOAC Int，2003，86（3）：576-582.

［14］Bezerra D S S，Silva M M S，Carvalho P H V D，et al．MSPD procedure combined with GC-MS for the determination of procymidone，bifenthrin，malathion and pirimicarb in honey［J］．Quim Nova，2010，33（6）：1348-1351.

［15］乔凤霞，孙汉文，刘广宇，等．基质固相分散-牛奶、蜂蜜中喹诺酮的多残留分析［J］．河北大学学报：自然科学版，2008，28（6）：620-624.

［16］周建科，张明翠，宋歌，等．基质固相分散-高效液相色谱法测定蜂蜜中三种酚类化合物 ［J］．食品研究与开发，2010，31（3）：142-144.

［17］余辉菊，杨晓松，杨胜利．基质固相分散-高效液相色谱法测定蜂蜜10种磺胺类药物 ［J］．中国食品卫生杂志，2011，23（2）：147-150.

［18］胡福良，朱威，李雅晶，等．蜂胶化学成分和生物学活性的多样性研究［J］．蜜蜂杂志，2006，26（1）：3-5.

［19］Santos T F S，Aquino A，Dórea H S，et al．MSPD procedure for determiningbuprofezin，tetradifon，vinclozolin，andbifenthrin residues in propolis by gas chromategraphy-mass spectrometry［J］．Anal Bioanal Chem，2008，390（5）：1425-1430.

［20］Pérez-Parada A，Colazzo M，Besil N，et al．Determination of coumaphos，chlorpyrifos and ethion residues in propolis tinctures by matrix solid-phase dispersion and gas chromatographycoupled to flame photometric and mass spectrometric detection［J］．J Chromatogr A，2011，1218（34）：5852-5857.

［21］Acosta-Tejada G M，Medina-Peralta S，Moguel-OrdóEz Y B，et al．Matrix solid-phase dispersion extraction of organophosphorus pesticides from propolis extracts and recovery evaluation by GC/MS ［J］．Anal Bioanal Chem，2011，400（3）：885-891.

［22］Medina-Dzul K，Muoz-Rodríguez D，Moguel-Ordoez Y，et al．Application of mixed solvents for elution of organophosphate pesticides extracted from raw propolis by matrix solid-phase dispersion and analysis by GC-MS［J］．Chem Pap，2014，68（11）：1474-1481.

［23］Medina-Dzul K，Carrera-Figueiras C，Pérez-Padilla Y，et al．SiO2/polyvinylimidazole hybrid polymer as a sorbent for extraction by matrix solid-phase dispersion（MSPD）：synthesis，characterization，and evaluation［J］．J Polym Res，2015，22（4）：45.

［24］刘建涛，赵利，苏伟，等．蜂花粉生物活性物质的研究进展［J］．食品科学，2006，27（12）：909-912.

［25］杨佳林，徐响，孙丽萍，等．蜂花粉酚类化合物研究进展［J］．食品科学，2008，29（8）：693-696.

［26］Sánchez-Brunete C，Miguel E，Albero B，et al．Determination of fipronil residues in honey and pollen by gas chromatography［J］．Span J Agric Res，2008，6（S1）：7-14.

［27］Torres-Perea C，Muozrodríguez D，Medinaperalta S，et al．Recovery evaluation of organophosphorus pesticides from bee pollen by matrix solid-phase dispersion extraction using sorbents based on silica and titania［C］．IOP Conf Ser Mater Sci Eng，2013，45（1）：9714-9722.

［28］Vazquez-Quintal P E，Muoz-Rodríguez D，Medina-Peralta S，et al．Extraction of organochlorine pesticides from bee pollen by matrix solid-phase dispersion：recovery evaluation by GC MS and method validation［J］．Chromatographia，2012，75（15-16）：923-930.

［29］Escobar-Arnanz J，Ramos L．The latest trends in the miniaturized treatment of solid samples［J］．Trends Anal Chem，2015，71：275-281.

［30］Ma S Q，Tu X J，Dong J T，et al．Soxhlet-assisted matrix solid phasedispersiontoextractflavonoidsfromrape（Brassica campestris）bee pollen［J］．J Chromatogr B，2015，1005：17-22.

Advances of matrix solid phase dispersion in honeybees and honeybee products analysis

Tu Xijuan Ma Shuangqin Gao Zhaosheng Chen Wenbin Wu Zhenhong Miao Xiaoqing
（College of Bee Science，Fujian Agriculture and Forestry University；Apitheraphy Institute of Fujian Agriculture and Forestry University；MOE Engineering Research Center of Bee Products Processing and Application，Fuzhou 350002）

Matrix solid phase dispersion（MSPD）is a sample preparation method which has been widely used for solid and semi-solid samples.This review summarizes the literatures on MSPD for the analysis of various compounds in honeybees and honeybee products.And parameters influencing the extraction and clean-up performance of MSPD are also reviewed.

Matrix solid phase dispersion；sample preparation；honeybee；honeybee products

福建省自然科学基金（2012J05037），国家自然科学基金（NO.31201861），国家蜂产业技术体系（CARS-45-KXJ19）

涂熹娟（1983-），女，讲师。Email：xjtu@fafu.edu.cn

缪晓青（1959-），男，教授，研究方向：蜂产品加工与应用。Email：mxqsf88@126.com