ErbB3/Her3基因重组慢病毒的构建及应用*

生秀梅， 王正新

1)江苏大学医学院生物化学教研室 镇江 212013　2)克拉克亚特兰大大学生物科学系肿瘤研究与治疗发展中心 亚特兰大 乔治亚州 30314



ErbB3/Her3基因重组慢病毒的构建及应用*

生秀梅1,2)△， 王正新2)

1)江苏大学医学院生物化学教研室 镇江 2120132)克拉克亚特兰大大学生物科学系肿瘤研究与治疗发展中心 亚特兰大 乔治亚州 30314

慢病毒；Her3；p44

目的：构建慢病毒Lenti-Her3，探索ErbB3/Her3在p44通路中的作用。方法：将ErbB3/Her3基因的两个片段Her3-1和Her3-2分段克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，构建慢病毒载体pCDH-Her3，然后将其包装成慢病毒Lenti-Her3；用Lenti-Her3感染经p44-shRNA沉默的A549细胞，细胞计数法检测细胞的生长情况，Western blot法检测 P44、Her3蛋白的表达。结果：转染p44-shRNA的A549细胞P44蛋白不表达，Her3蛋白表达显著降低，细胞计数显著降低；Lenti-Her3感染后，p44沉默的A549细胞Her3蛋白表达显著增强，细胞计数有所升高(P<0.05)，但未达到正常水平。结论：成功构建了重组慢病毒Lenti-Her3；p44可部分通过Her3促进肺癌A549细胞的生长，可能成为肺癌药物研究的新靶点。

ErbB3/Her3是ErbB酪氨酸激酶受体家族的一员。该家族包括EGFR(ErbB1/Her1)、ErbB2(Her2/neu)、ErbB3(Her3)和ErbB4(Her4)[1-2]。ErbB家族在控制细胞生长的过程中发挥非常重要的功能[3-4]。这些受体的过表达或突变与多种肿瘤的发生发展、患者预后不良有关[3]。ErbB3/Her3参与肺癌A549细胞的分裂、存活、转移和侵袭过程，其高表达与肺癌患者的预后不良密切相关[5-9]。p44/WDR77 对肺癌上皮细胞及肺部肿瘤的发生至关重要[10]。沉默p44的表达后，体外培养的A549细胞及裸鼠移植瘤均不再生长[10-11]。利用DNA芯片表达谱分析发现通过shRNA沉默A549细胞中p44的表达后，ErbB3/Her3的表达显著下调。据此，该研究拟构建ErbB3/Her3慢病毒，用其感染经p44-shRNA沉默的A549细胞，观察A549细胞的生长情况，探索ErbB3/Her3在p44通路中的作用。

1　材料与方法

1.1材料pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒载体及病毒包装系统购自SBI公司； A549细胞、293T细胞、pRL-CMV及E.coliXL 10-gold感受态细胞由本室保存；NT-shRNA、p44-shRNA慢病毒均由本室构建；Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；人ErbB3/Her3基因cDNA克隆(HSCD00038359)购自DNASU。

1.2沉默p44 后A549细胞中ErbB3/Her3 mRNA表达水平的检测应用Real-time PCR法检测。采用Trizol法一步提取经NT-shRNA(阴性对照)或p44-shRNA慢病毒感染6 d后的A549细胞的总RNA，经反转录 (试剂盒为SuperArray Bioscience Corp产品)得cDNA，以cDNA为模板，扩增Her3 mRNA，以人β-actin作为内参。Her3上游引物序列:5’-GGTGCTGGGCTTGCTTTT-3’，下游引物序列:5’-CGTGGCTGGAGTTGGTGTTA-3’，产物长度为365 bp。用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达水平。

1.3慢病毒Lenti-Her3的构建

1.3.1重组慢病毒载体pCDH-Her3的构建GenBank注册的ErbB3/Her3序列(NM_001982)显示ErbB3/Her3基因全长为4 029 bp，酶切位点分析显示ErbB3/Her3基因在2 100 bp附近有一个BamH Ⅰ酶切位点，故考虑分段克隆。首先将BamH Ⅰ酶切位点上游区段克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，构建pCDH-Her3-1，再将BamH Ⅰ酶切位点下游区段克隆至pCDH-Her3-1，构建完整的pCDH-Her3。BamH Ⅰ上游区段上、下游引物(Her3-1-F和Her3-1-R)序列分别为：5’-GCTCTAGAAT GAGGGCGAACGACGC TC-3’和5’-GCCGTC CACTCTTGTCCTC-3’(上游引物5’端加接XbaⅠ酶切位点序列，扩增产物中包含BamH Ⅰ酶切位点)；下游区段上、下游引物(Her3-2-F和Her3-2-R)序列分别为：5’-GGGTGTCTTTGGAACTGTG-3’和5’-ATA AGAATGCGGCCGCCGTTCTCTGGGCATTAGCC-3’(下游引物5’端加接NotⅠ酶切位点序列，扩增产物中包含BamH Ⅰ酶切位点)。以含有ErbB3/Her3基因cDNA克隆质粒为模板，分别以Her3-1-F/R和Her3-2-F/R为引物进行PCR，获取目的基因Her3-1和Her3-2。Her3-1 PCR产物胶回收；pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro用FLAG标记，然后经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切；将上述两产物用T4 DNA连接酶室温连接过夜，将连接产物转化至E.coliXL 10-gold；提取阳性克隆(克隆1)质粒，双酶切验证。Her3-2 PCR产物经胶回收后用NotⅠ和BamHⅠ双酶切，与克隆1经T4 DNA连接酶室温连接过夜，将连接产物转化至E.coliXL 10-gold，提取阳性克隆(克隆2)，经双酶切验证后，通过DNA测序分析最终确认。

1.3.2pCDH-Her3的筛选PC3细胞接种于24孔板中，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，至细胞密度为50%～80%时，更换为无血清无抗生素培养基，取100 ng pCDH-Her3或100 ng pCDH空载体与5 ng pRL-CMV经Lipofectamine2000转染试剂共转染PC3细胞，6 h后，换新鲜含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，48 h后收集PC3细胞，Western blot法检测Her3蛋白的表达，选择Her3表达较高的pCDH-Her3用于慢病毒的包装。

1.5统计学处理采用SPSS 17.0进行数据处理。4组各指标的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1沉默p44后A549细胞ErbB3/Her3 mRNA的表达情况沉默A549细胞中p44的表达后，ErbB3/Her3 mRNA的表达下调48倍。

2.2重组慢病毒Lenti-Her3的鉴定

2.2.1慢病毒载体pCDH-Her3的鉴定pCDH-Her3经XbaⅠ和NotⅠ双酶切后电泳可见4 000 bp左右片段，DNA测序亦完全正确，见图1。

A1： Her3-2 PCR产物；A2：Her3-1 PCR产物；B1：pCDH-Her3酶切鉴定结果；M：1 kb plus DNA Ladder。图1　慢病毒载体pCDH-Her3的酶切鉴定

2.2.2慢病毒载体的筛选将pCDH-Her3与pRL-CMV经Lipofectamine2000共转染PC3细胞后， Western blot检测结果显示(图2)，对照空载体pCDH转染的PC3细胞检测不到Her3蛋白的表达，经pCDH-Her3转染的PC3细胞均检测到Her3蛋白的表达，最终选择Her3蛋白表达较高的2号泳道对应的pCDH-Her3用于慢病毒的包装，进行后续实验。

1: pCDH转染的PC3； 2、3：pCDH-Her3转染的PC3。图2　Western blot法检测pCDH-Her3转染后PC3细胞中Her3蛋白的表达

2.2.3A549细胞感染慢病毒Lenti-Her3后Her3蛋白的表达使用不同浓度的慢病毒Lenti-Her3感染A549细胞后，Western blot法检测Her3的表达，结果(图3)显示，A549细胞感染Lenti-Her3后可大量表达Her3蛋白。

1： 空病毒对照组；2～5：30、50、100和200 μL Lenti-Her3组。图3　Western blot法检测Lenti-Her3感染后A549细胞中Her3蛋白的表达

2.3Lenti-Her3慢病毒感染后p44沉默的A549细胞中P44、Her3蛋白的表达见图4、表1。P44沉默的A549细胞中Her3蛋白高表达，且与加入的Lenti-Her3病毒量呈正相关。

1:NT-shRNA组;2:p44-shRNA组;3：p44-shRNA+50 μL Lenti-Her3组;4：p44-shRNA+100 μL Lenti-Her3组。图4　p44沉默的A549细胞Her3蛋白的表达

2.4Lenti-Her3慢病毒感染后p44沉默的A549细胞的生长状况见表1。p44-shRNA转染6 d后，A549细胞计数明显下降；再感染Lenti-Her3后，细胞计数有所上升，但并未恢复到NT-shRNA组水平。

表1　病毒感染后4组A549细胞P44、Her3蛋白表达和细胞计数的比较

*:与NT-shRNA组相比，P<0.001;#:与p44-shRNA组相比,P<0.05;△：与p44-shRNA+50 μL Lenti-Her3组比较，P<0.05。

3　讨论

p44/WDR77 是一种原癌基因，可促进肺癌上皮细胞生长及肺部肿瘤的发生。沉默p44的表达后，A549细胞中ErbB3/Her3的表达显著下调[10]；该研究也再次验证了这一结果。为进一步探讨Her3是否介导p44的促A549细胞生长的作用，作者构建了重组慢病毒Lenti-Her3，用其感染沉默p44表达后的A549细胞，用以增强其Her3蛋白的表达，结果显示Her3可部分恢复A549细胞的生长，说明p44可部分通过Her3促进A549细胞的生长，但其具体机制仍有待进一步研究。

ErbB3/Her3基因位于12号染色体上，编码160 000的跨膜蛋白受体，与EGFR(ErbB1/Her1)、ErbB2(Her2/neu)和ErbB4(Her4)同属于酪氨酸激酶受体家族[1,12]。该家族成员的蛋白结构中包含3个结构区：胞外区域、跨膜区域和胞内区域，其中胞外区域是配体结合区，而胞内部分具有酪氨酸蛋白激酶活性[4,13]。配体和ErbB同源或异源二聚体结合后，激活其酪氨酸激酶活性，使其胞内区域酪氨酸残基自磷酸化，从而激活下游信号转导通路[14-15]。ErbB3/Her3没有激酶活性， ErbB2/Her2没有配体结合功能，两者通常都与其他家族成员形成异源二聚体发挥功能[9,16-17]。另有研究[14]表明ErbB3/Her3和ErbB2/Her2形成二聚体通过激活PI3K/Akt通路从而调节肺腺癌细胞的生长。后续实验可考虑在沉默p44表达的A549细胞中同时表达ErbB3/Her3和ErbB2/Her2，观察A549细胞的生长，为研究 p44通路奠定基础。

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(2015-11-26收稿责任编辑王曼)

Construction and application of recombinant ErbB3/Her3 lentiviral

SHENGXiumei1,2)，WANGZhengxin2)

1)DepartmentofBiochemistry,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang2120132)TheCenterforCancerResearchandTherapeuticDevelopment,DepartmentofBiologicalSciences,ClarkAtlantaUniversity,Atlanta,GA30314

lentiviral;Her3;p44

Aim: To construct lentiviral Lenti-Her3 and identify ErbB3/Her3 function in p44 pathway. Methods: Her3-1 and Her3-2 fragments of ErbB3/Her3 gene were cloned in turn into pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro to generate pCDH-Her3，and then was packaged to obtain Lenti-Her3. Lenti-Her3 was infected in A549 cells which had been transfected with p44-shRNA, and then expressions of P44 and Her3 proteins were detected by Western blot, cell growth was detected through cell counting. Results: The A549 cells transfected with p44-shRNA had no expression of P44 protein, low expression of Her3 protein, and low cell number counting. The expression of Her3 protein in the A549 cells transfected with p44-shRNA and infected with Lenti-Her3 was improved, and cell number counting was increased, but did not reach the normal level. Conclusion: The lentiviral Lenti-Her3 has been successfully constructed;p44 could promote lung cancer cell growth partially by Her3 pathway, which may be a potential therapeutic target for lung cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.004

*国家自然科学基金项目31000046；江苏大学高级人才启动基金11JD063；国家博士后基金面上项目2015M571702

△女，1978年1月生，博士，副教授，研究方向：肿瘤的发生发展机制及细菌致病机制，E-mail:shengxiumei@ujs.edu.cn

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