注射用头孢噻肟钠无菌检查方法的适用性试验探讨

罗　丹（东北制药集团沈阳第一制药有限公司　沈阳　110027）

注射用头孢噻肟钠无菌检查方法的适用性试验探讨

罗丹（东北制药集团沈阳第一制药有限公司沈阳110027）

按照《中华人民共和国药典》（2015年版四部）通则1101无菌检查法中适用性试验的要求，采用薄膜过滤法，对注射用头孢噻肟钠无菌检查方法的适用性试验进行实验室研究。研究发现，以80，000IU头孢菌素酶作为中和剂，冲洗量为300mL，注射用头孢噻肟钠抑菌作用可以完全消除。可以采用薄膜过滤法对注射用头孢噻肟钠进行无菌检查。

头孢噻肟钠 无菌检验 头孢菌素酶

头孢噻肟钠（Cefotaxime Sodium，CTX）是第三代半合成头孢类广谱抗生素，对铜绿假单胞菌、不动杆菌、沙雷杆菌、某些厌氧球菌，以及部分脆弱拟杆菌等具有不同程度的抑制作用［1］。对嗜血杆菌的作用与第二代头孢菌素产品接近，对大肠埃希菌及变型杆菌等头孢菌素敏感的革兰阴性菌也有较好的抑制作用［2］。

《中华人民共和国药典》（2015年版四部）通则1101无菌检查法要求，无菌制剂必须进行无菌检查。在对具有抗菌活性药品进行无菌检查时，应首先消除其抗菌活性，并通过试验验证其抗菌活性去除是否彻底，保证检验结果的有效性。头孢噻肟钠对革兰阴性菌有较强的抑菌作用，如何有效地去除抑菌作用，是其方法验证的关键。通则1101无菌检查法中提出为消除β-内酰胺类抗生素的抑菌性，采用薄膜过滤法可以加入中和剂β-内酰胺酶，去除残留在滤膜上的头孢菌素。本文作者对注射用头孢噻肟钠无菌检查方法的验证进行了实验室研究，为将来对其建立系统的无菌检查方法提供技术参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种：金黄色葡萄球菌Staphylococcu aureus CMCC（B）26003、大肠埃希菌Escherichia coli CMCC（B）44102、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CMCC（B）63501、生孢梭菌Clostridium sporogenes CMCC（B）64941、黑曲霉 Aspergillus niger CMCC（F）98003、白色念珠菌Candida albicans CMCC（F）98001（均来自中国药品生物制品检定所）。

1.1.2培养基：胰酪大豆胨液体培养基（批号20151016，北京奥博星生物技术有限责任公司）、硫乙醇酸盐流体培养基（批号20160406，青岛高科园海博生物技术有限公司）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号20150316，北京奥博星生物技术有限责任公司）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号1405072，北京三药科技开发有限公司），灵敏度试验均符合《中华人民共和国药典》（2015年版四部）通则1101无菌检查法规定。

1.1.3试剂及缓冲液：注射用头孢噻肟钠（批号150214，规格1.0g，东北制药集团沈阳第一制药有限公司），青霉素酶（批号：130441-201401，规格：3，000，000IU/mL，中国药品生物制品检定所），头孢菌素酶（批号：20151204，规格：2，000，000IU/支，杭州北望生物技术有限公司），0.9%无菌氯化钠溶液：氯化钠9g，溶解于1L蒸馏水中。

1.1.4仪器及培养器：HTY-2000B型智能集菌仪及一次性全封闭集菌培养器KDGB330（杭州泰林生物技术设备有限公司）；培养箱（型号SHP-150，上海精宏试验设备有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（型号DHG-9246A，上海精宏试验设备有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（型号YXQ-LS-100SII，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2方法

1.2.1试验菌悬液的制备：接种S.aureus CMCC（B）26003、B. subtilis CMCC（B）63501和E.coli CMCC（B）44102至胰酪大豆胨液体培养基中，30℃～35℃恒温培养18～24h；接种C.sporogenes CMCC（B）64941至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃恒温培养18～24h；接种C.albicans CMCC（F）98001至沙氏葡萄糖液体培养基中，20℃～25℃培养24～48h。上述培养物用0.9%氯化钠溶液制成每1mL含菌数小于100cfu的菌悬液。接种A.niger CMCC（F）98003至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，20℃～25℃培养5～7d，加入5mL含0.05%聚山梨酯-80的0.9%氯化钠溶液洗下霉菌孢子。然后，将孢子悬液移至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯-80的0.9%氯化钠溶液制成每1mL含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

1.2.2无菌检查方法验证试验：试验分为三组：①试验组：取供试品30支，全部溶解于0.9%无菌氯化钠溶液500mL中。按薄膜过滤法过滤，每个滤筒用pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液300mL冲洗，每次100mL，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌悬液，过滤。滤筒中分别加入100mL硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基；②阳性对照组：另取滤筒，加入同体积培养基，并接种等量的试验菌，作为阳性对照；③阴性对照组：以等量的稀释剂代替供试液，不接种试验菌，其他操作同试验组。其中，硫乙醇酸盐流体培养基在30℃～35℃恒温培养3d，胰酪大豆胨液体培养基在20℃～25℃恒温培养5d，观察结果［3］。

2　结果与分析

2.1不添加中和剂无菌检查方法的适用性试验：采用薄膜过滤法，不添加中和剂，对注射用头孢噻肟钠进行无菌检查方法适用性试验，阴性对照组结果均为阴性，试验组结果见表1，阳性对照组结果见表2。

表1　不加中和剂无菌检查方法适用性试验—试验组结果Table 1 Test group results of the sterility test method experiment with no neutralizer

表2　不加中和剂无菌检查方法适用性试验—阳性对照组结果Table 2 Positive control group results of the sterility test method experiment with no neutralizer

从表1和表2的结果可以看出，注射用头孢噻肟钠主要抑制E.coli CMCC（B）44102的生长，该菌为头孢噻肟钠的敏感菌株，所以添加中和剂进行头孢噻肟钠无菌检查方法的验证试验，只需选择E.coli CMCC（B）44102作为试验菌。

2.2添加中和剂无菌检查方法的验证试验：另取供试品按“1.2.2”项下操作，以E.coli CMCC（B）44102作为试验菌，分别添加300万单位青霉素酶和8万单位头孢菌素酶作为中和剂（每100mL培养基），对注射用头孢噻肟钠进行无菌检查方法的适用性试验，阳性对照组结果为阳性，阴性对照组结果为阴性，试验组结果见表3和表4。

表3　添加青霉素酶中和剂对大肠埃希菌无菌检查方法适用性试验—试验组结果Table 3 Test group results of the sterility test method experiment with penicillinase as a neutralizer to E.coli CMCC（B）44102

表4　添加头孢菌素酶中和剂对大肠埃希菌无菌检查方法适用性试验—试验组结果Table 4 Test group results of the sterility test method experiment with cephalosporin enzyme as a neutralizer to E.coli CMCC（B）44102

从表3和表4的结果可以看出，加入头孢菌素酶后无菌检查方法的适用性试验，每筒需要消耗冲洗液的体积为300mL，而加入青霉素酶则每筒则需要消耗800mL冲洗液，前者消除抑菌活性的作用优于后者，故选择加入头孢菌素酶作为中和剂对注射用头孢噻肟钠进行无菌检查。

3　讨论

注射用头孢噻肟钠作为头孢菌素类抗生素，具有较强的抑菌作用。根据《中华人民共和国药典》（2015年版四部）通则1101无菌检查法要求，对β-内酰胺类药品进行无菌检查时，可在样品溶液、培养基或冲洗液中加入β-内酰胺酶消除抑菌性。

本文对注射用头孢噻肟钠无菌检查方法的适用性试验进行了实验室研究。研究发现，如果无菌检查方法适用性试验过程中没有加入中和剂，敏感菌株大肠埃希菌被残留的药物活性成分抑制，无法正常生长。在验证过程中加入青霉素酶和头孢菌素酶后，发现二者均能不同程度消除抑菌。但通过试验比较发现，头孢菌素酶消除抑菌活性的效果优于青霉素酶。前者不但使用量少，所用的冲洗量也减少，大大降低注射用头孢噻肟钠无菌检验的时间和成本，提高检验效率。

注射用头孢噻肟钠无菌检查采用薄膜过滤法以E.coli CMCC（B）44102作为敏感试验菌，冲洗液为pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，冲洗量为300mL，以每100mL培养基中加入8万单位头孢菌素酶作为中和剂，试验组与阳性对照组比较均生长良好，说明头孢噻肟钠在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计，按此方法对注射用头孢噻肟钠注射液进行无菌检查所得结果准确、有效。同时，也说明各类注射用头孢菌素类药品的无菌检验方法可简化、统一，形成标准操作规范。而其他各类药品的微生物检查方法，经长期大量的系统方法学研究，也可逐步规范、统一，成为药品标准正文，至于目前缺少验证方法造成的问题也将逐步得到解决。

［1］李晶，张美芸，李全民.用铁氰化钾分光光度法测定头孢噻肟钠［J］.应用化学，2011，28（1）：88-93.

［2］张晔，徐峰，吴玮峰.头孢噻肟钠在不同注射液中的稳定性及抗菌活性研究［J］.中国医药导刊，2014，16（6）：1097-1098.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）［S］.北京，中国医药科技出版社，2015.

R978.1+1

B

1672-8351（2016）09-0129-03